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本發(fā)明公開了一種產(chǎn)角蛋白酶的粘金黃桿菌及其分離方法。所述粘金黃桿菌拉丁名為Chryseobac？terium？L99，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC？No.2295。本發(fā)明公開了該菌的形態(tài)學(xué)特征為：菌體桿狀，不產(chǎn)孢子，無運(yùn)動(dòng)性，革蘭氏染色呈陰性。本發(fā)明公開了該菌的全細(xì)胞脂肪酸主要成份為：十三甲基十四酸47.59％，二羥基-13-甲基十四酸和(或)Ω-7-順式-13甲基-十五酸15.72％，三羥基-15-甲基十六酸13.91％，Ω-9-順式-14甲基棕櫚酸9.48％。本發(fā)明還公開了該菌的16S核糖體DNA(16S？rDNA)全序列。本發(fā)明公開的分離方法包括三個(gè)步驟：普通營養(yǎng)培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，以角蛋白為唯一碳氮源固體培養(yǎng)基初篩，以角蛋白為唯一碳氮源液體培養(yǎng)基的復(fù)篩。該方法快捷有效，所得菌種產(chǎn)酶能力強(qiáng)。

本發(fā)明公開了一種蝶蛹金小蜂毒液絲氨酸蛋白酶抑制劑Pp-PI多肽，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還同時(shí)公開了編碼上述蝶蛹金小蜂毒液絲氨酸蛋白酶抑制劑Pp-PI多肽的基因，其具有SEQ ID NO：1中第126-290位的核苷酸序列；或者與SEQ IDNO：1中從核苷酸第126-290位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者其核苷酸序列能在40-55℃條件下與SEQ ID NO：1中從核苷酸第126-290位的核苷酸序列雜交。上述蝶蛹金小蜂毒液絲氨酸蛋白酶抑制劑Pp-PI多肽能用于制備蝶蛹金小蜂毒液絲氨酸蛋白酶抑制劑，用于轉(zhuǎn)基因作物或改造植物共生菌。

蛋白酶體是細(xì)胞用來調(diào)控特定蛋白質(zhì)的濃度和清除錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的主要機(jī)制，是細(xì)胞中最普遍的不可或缺的大型 蛋白復(fù)合機(jī)器之一，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最大的蛋白降解機(jī)器。 蛋白酶體全酶是由蓋子 (Lid)和基座(Base)亞復(fù) 合體組成的調(diào)控顆粒RP(Regulatory Particle)所激活。基座亞復(fù)合體在組裝過程中最重要的一個(gè)步驟是異質(zhì)六 聚AAA-ATPase環(huán)的組裝。這個(gè)過程至少需要被PAAF1, p28/gankyrin, p27/PSMD9和S5b這四種調(diào)控顆粒(RP)組 裝伴侶蛋白分子所引導(dǎo)。天然的自由態(tài)19S調(diào)控復(fù)合體的構(gòu)象存在大量的亞穩(wěn)定態(tài)，并表現(xiàn)出大幅度的局部構(gòu)象漲 落，使冷凍電子顯微鏡技術(shù)成為解析其結(jié)構(gòu)的唯一手段。利用 冷凍電鏡解析人源蛋白酶體全酶的基礎(chǔ)上（見PNAS 2016, 113: 12991-12996），利用他們自主開發(fā)的基于統(tǒng)計(jì) 流行算法的高性能計(jì)算軟件ROME（見PLoS ONE 2017, 12:e0182130）與優(yōu)化的冷凍電鏡處理方法對p28-RP復(fù)合 體細(xì)微動(dòng)態(tài)構(gòu)象進(jìn)行深度分類，共解析出了1個(gè)4.5-? p28綁定的調(diào)控顆粒（RP）非AAA的亞復(fù)合體，3個(gè)近7-? p28 綁定的完整RP結(jié)構(gòu)，1個(gè)亞納米精度下的非p28綁定的完整RP結(jié)構(gòu)以及7個(gè)亞納米精度下的由Rpn1-p28-AAA組成的p28 綁定RP的亞復(fù)合體的動(dòng)態(tài)構(gòu)象。觀察到自由態(tài)RP調(diào)控顆粒中p28-綁定的AAA環(huán)并沒有組成的閉 環(huán)孔狀通道，而是自發(fā)地在Rpt2-Rpt6和Rpt3-Rpt4界面上形成多個(gè)由“開”到“關(guān)”的拓?fù)渥儤?gòu)。

本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品加工及副產(chǎn)品綜合利用技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明對大豆乳清蛋白 廢水綜合利用，原料無需干燥，設(shè)備要求低，操作簡單，無環(huán)境污染。且 Kunitz型胰蛋白酶抑制劑回收率高，純度高，蛋白活性高。 低濃度的胰蛋白酶抑制劑是廣譜抗致癌因子，能預(yù)防結(jié)腸癌、肝癌、口腔癌、肺癌等多種癌癥的發(fā)生，還有降低膽固醇水平的作用；能增強(qiáng)胰臟生長和增加胰消化酶的活性，且對動(dòng)物內(nèi)皮細(xì)胞生長因子具有活化作用；能控制腎小球腎炎或腎盂腎炎的一些炎癥發(fā)展過程。此外，微量胰蛋白酶抑制劑對于糖尿病治療，調(diào)節(jié)胰島素失調(diào)有一定效果。醫(yī)藥上提取胰蛋白酶抑制劑(抑肽酶) 治療急性胰腺炎

α-淀粉酶抑制劑是一種純天然生物活性物質(zhì)，屬于糖水解酶抑制劑的一種。 α-淀粉酶抑制劑通過對淀粉酶的抑制作用而發(fā)揮減肥效應(yīng)，并經(jīng)胃腸道排出體外，因此不必進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，不作用于大腦中樞，減肥的同時(shí)不抑制食欲，使用劑量很高時(shí)也無副作用，符合世界衛(wèi)生組織的減肥原則。對于肥胖患者，可減少糖向脂肪轉(zhuǎn)化，延緩腸道的排空，增加脂肪消耗以減少體重。因此，能用α-淀粉酶抑制劑來防止和治療肥胖癥、脂肪過多癥、動(dòng)脈硬化癥、高血脂及糖尿病等。另外，純化的α-淀粉酶抑制肽的另一重要作用是作為糖尿病的輔助治療（中藥一類），可以阻礙或延緩其對食物中主要的碳水化合物淀粉的消化作用，阻止血糖的升高，從而能使糖尿病人吃飽飯，消除饑餓感。本成果利用固液萃取技術(shù)、膜技術(shù)、雙水相萃取技術(shù)和層析技術(shù)等現(xiàn)代生物分離技術(shù)從小麥中分離純化了 -淀粉酶抑制劑（ -淀粉酶抑制劑的活性大于2500U/mg.protein），達(dá)到了日本國應(yīng)用的要求。新工藝較原工藝相比具有操作方便，收率高，成本低，產(chǎn)品質(zhì)量好，易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。據(jù)悉，歐美已將 -淀粉酶抑制劑開發(fā)成保健食品,如starch blocker。每年的用量在100噸以上，且近年來每年以30％的速度在遞增。預(yù)計(jì)到2010年我國將有2億人口加入肥胖者行列，而糖尿病早已成為我國中老年人的常見病、多發(fā)病，因此將本成果應(yīng)用于治療上述疾病方面是極有市場潛力的。

11月4日，天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王濤課題組在Journal of Virology在線發(fā)表了最新研究成果，論文題目為“Enterovirus D68 Protease 2AproTargets TRAF3 to Subvert Host Innate Immune Responses”。 腸道病毒EV-D68（Enterovirus D68）可引起典型上呼吸道感染癥狀，同時(shí)還會誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如急性弛緩性麻痹和急性無力脊髓炎等。近年來，我國對EV-D68的檢出率逐漸升高，存在大規(guī)模暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。腸道病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白2A蛋白酶（2Apro）是協(xié)助病毒逃避宿主天然免疫的關(guān)鍵蛋白。 王濤團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在感染EV-D68后，2Apro可顯著抑制SEV誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素反應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，2Apro能夠分別在HeLa和HEK293T細(xì)胞中切割TRAF3的C端區(qū)域，切割后得到的條帶大小為40 kDa左右。同時(shí)，2Apro中第107位氨基酸的半胱氨酸被丙氨酸取代后，喪失對TRAF3的切割活性，而TRAF3中第462位氨基酸甘氨酸突變?yōu)楸彼釙r(shí)，表現(xiàn)出對2Apro切割的抗性。 本研究發(fā)現(xiàn)了EV-D68的2Apro能夠切割宿主天然免疫通路中的TRAF3蛋白，從而破壞宿主的先天免疫應(yīng)答，并對2Apro和TRAF3切割的具體位點(diǎn)和機(jī)制做了詳細(xì)報(bào)道。

項(xiàng)目成果/簡介:11月4日，天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王濤課題組在Journal of Virology在線發(fā)表了最新研究成果，論文題目為“Enterovirus D68 Protease 2AproTargets TRAF3 to Subvert Host Innate Immune Responses”。 腸道病毒EV-D68（Enterovirus D68）可引起典型上呼吸道感染癥狀，同時(shí)還會誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如急性弛緩性麻痹和急性無力脊髓炎等。近年來，我國對EV-D68的檢出率逐漸升高，存在大規(guī)模暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。腸道病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白2A蛋白酶（2Apro）是協(xié)助病毒逃避宿主天然免疫的關(guān)鍵蛋白。 王濤團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在感染EV-D68后，2Apro可顯著抑制SEV誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素反應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，2Apro能夠分別在HeLa和HEK293T細(xì)胞中切割TRAF3的C端區(qū)域，切割后得到的條帶大小為40 kDa左右。同時(shí)，2Apro中第107位氨基酸的半胱氨酸被丙氨酸取代后，喪失對TRAF3的切割活性，而TRAF3中第462位氨基酸甘氨酸突變?yōu)楸彼釙r(shí)，表現(xiàn)出對2Apro切割的抗性。 本研究發(fā)現(xiàn)了EV-D68的2Apro能夠切割宿主天然免疫通路中的TRAF3蛋白，從而破壞宿主的先天免疫應(yīng)答，并對2Apro和TRAF3切割的具體位點(diǎn)和機(jī)制做了詳細(xì)報(bào)道。

蛋白酶體是細(xì)胞中用來調(diào)控特定蛋白質(zhì)的濃度和清除錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的主要機(jī)制的核心組成部分，是細(xì)胞中最普遍的不可或缺的大型全酶超分子復(fù)合機(jī)器之一，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最大的蛋白降解機(jī)器。人源蛋白酶體全酶包含至少64個(gè)亞基，由蓋子 (Lid)和基座(Base)亞復(fù)合體組成的調(diào)控顆粒RP(Regulatory Particle)所激活。2016年，該課題組與其合作者在《美國科學(xué)院院刊》報(bào)道了人源蛋白酶體的基態(tài)近原子分辨的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，以及三個(gè)亞納米分辨的RP-CP亞復(fù)合體亞穩(wěn)或過渡態(tài)的共存結(jié)構(gòu)，并首次發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象的CP的底物轉(zhuǎn)運(yùn)通道處于開放狀態(tài)（見PNAS 2016, 113: 12991-12996）。這一發(fā)現(xiàn)被德國馬普所Baumeister課題組及其合作者在2017年的一篇《美國科學(xué)院院刊》論文中通過酵母蛋白酶體全酶的冷凍電鏡亞納米精度分析進(jìn)一步證實(shí)、引用和比較（見PNAS 2017, 114, 1305-1310）。然而，在這些工作中，CP開放態(tài)的全酶結(jié)構(gòu)離近原子分辨還有較大距離，未能充分揭示人源蛋白酶體全酶的激活后的運(yùn)動(dòng)行為。毛有東、歐陽頎課題組及其合作者在前期工作的基礎(chǔ)上，利用他們自主開發(fā)的基于統(tǒng)計(jì)流行算法的高性能計(jì)算軟件ROME（見PLoS ONE 2017, 12:e0182130）與優(yōu)化的冷凍電鏡處理方法，對ATP-γS結(jié)合狀態(tài)下的人源蛋白酶體的全酶冷凍電鏡單顆粒數(shù)據(jù)展開了深入分析，得到了6個(gè)共存的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，其中包括3.6埃分辨率的基態(tài)結(jié)構(gòu)，3.5埃的開放態(tài)CP結(jié)構(gòu)，和三個(gè)CP開放態(tài)對應(yīng)的亞穩(wěn)簡并態(tài)全酶4.2埃，4.3埃和4.9埃的結(jié)構(gòu)。另外兩個(gè)中間態(tài)結(jié)構(gòu)分辨率為7.0埃和5.8埃。三個(gè)CP開放態(tài)對應(yīng)的全酶結(jié)構(gòu)的主要差別在于位于RP的AAA-ATPase激酶馬達(dá)模塊，伴隨其不同的構(gòu)象變化，至少有四個(gè)ATP-γS分子穩(wěn)定結(jié)合在不同的AAA-ATPase亞基上，為其在不同核酸結(jié)合狀態(tài)下形成的非穩(wěn)定動(dòng)態(tài)構(gòu)象提供了重要證據(jù)。該研究首次觀察到位于AAA-ATPase激酶馬達(dá)模塊中心的底物轉(zhuǎn)運(yùn)通道呈現(xiàn)從螺旋到鞍形不同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)變化，為進(jìn)一步分析底物和蛋白酶體全酶的相互作用奠定了重要基礎(chǔ)。人源蛋白酶體全酶AAA-ATPase馬達(dá)模塊中心的底物轉(zhuǎn)運(yùn)通道發(fā)生大幅度的拓?fù)渥儤?gòu)

研究內(nèi)容 ：本研究采用復(fù)合酶法水解蠶蛹蛋白制備免疫調(diào)節(jié)活性多 肽，得到最佳的水解工藝條件。在最佳水解條件下，酶解后蛋白質(zhì)得率為 57.24%，小分子多肽得率為 32.16%。該結(jié)果達(dá)到了計(jì)劃指標(biāo)，即蛋白質(zhì) 得率>40%，小分子多肽得率 >20%。另外，本研究探討了水解條件與分子 量大小，分子量大小與免疫調(diào)節(jié)活性的關(guān)系，同時(shí)建立了毛細(xì)管凝膠電泳 測定蠶蛹多肽分子的檢測方法。 技術(shù)特點(diǎn) ：本研究

項(xiàng)目以花生等高含油油料作物為原料，集成可控酶解、連續(xù)三相分離、膜分 離濃縮、高效破乳等技術(shù)，從油料中提取油脂與水解蛋白，工藝路線較為簡單， 實(shí)驗(yàn)室小試條件下，游離油與水解蛋白得率分別達(dá)到 93%和 87%，中試實(shí)驗(yàn)中， 游離油得率和水解蛋白得率均達(dá)到 80%左右，所得花生油達(dá)到國家三級花生油的標(biāo)準(zhǔn)。該深加工技術(shù)大大提高了花生的附加值，為花生的高效利用提供了一種有 廣泛市場前景的途徑。 創(chuàng)新要點(diǎn) （1）處理?xiàng)l件溫和，可得到無黃曲霉毒素污染、無溶劑殘留的高質(zhì)量的油 脂，同時(shí)有效回收原料中的蛋白質(zhì)； （2）工藝綠色環(huán)保，比現(xiàn)行分離蛋白工藝更為節(jié)能降耗