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類脂 A 是脂多糖分子的疏水基團(tuán)，大量存在于革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜外層，能通過結(jié)合免疫細(xì)胞表面的受體 TLR4 來刺激人體免疫系統(tǒng)[50, 51]，因而也是一種很好的免疫系統(tǒng)激活因子。美國 Corexa 公司已經(jīng)開發(fā)出了可用于乙肝病毒疫苗和過敏治療的疫苗佐劑 MPL。研究表明 MPL 刺激的免疫細(xì)胞中 IL-1β 的分泌量 顯著降低，使得 MPL 的毒性降低但免疫活性還在。MPL 目前是通過從沙門氏菌的 突變株 Salmonella minnesota RC595 中提取類脂 A，然后用化學(xué)方法去除其多余的附加基團(tuán)而得到。本項(xiàng)目擬利用這些類脂 A 修飾酶，根據(jù)類脂 A 分子的合成機(jī)理，通過基因工程技術(shù)將大腸桿菌中類脂 A 的結(jié)構(gòu)改造成為 MPL，構(gòu)建能合成 MPL 的大腸桿菌。這種新型的能合成 MPL 的大腸桿菌不僅可以作為宿主菌安全使用于食品和藥物的發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中，而且可以作為實(shí)驗(yàn)室研究中更安全的基因表達(dá)載體，最重要的是它可以直接用來生產(chǎn)類脂 A 疫苗佐劑 MPL

已有樣品/n成功構(gòu)建了新型黑猩猩型腺病毒AdC68和AdC7作為疫苗載體，以此為基礎(chǔ)，分別研制了兩種新型的埃博拉疫苗，即AdC68-EBOVgp、AdC7-EBOVgp，并在小鼠、非人靈長類動(dòng)物中都驗(yàn)證其免疫原性及保護(hù)性效果。對于埃博拉疫情的控制，目前尚無有效手段，以黑猩猩型腺病毒為載體的新型埃博拉疫苗的研發(fā)成功不僅將滿足患者的需求，而且將解決這一重大的公共衛(wèi)生問題，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和重大的社會(huì)價(jià)值。

本發(fā)明公開一種制備熱穩(wěn)定疫苗的方法，特別涉及一種聯(lián)合使用基因工程和仿生礦化技術(shù)制備熱穩(wěn)定疫苗的方法。本發(fā)明提供一種利用基因工程技術(shù)在疫苗表面引入具有誘導(dǎo)無機(jī)物礦化能力的多肽的方法；(1)構(gòu)建疫苗的基因克隆；(2)將多肽的核酸序列插入疫苗基因克隆中，得到重組克隆；(3)將重組克隆在細(xì)胞或大腸桿菌內(nèi)表達(dá)，得到具有自礦化能力的疫苗。本發(fā)明還一種制備鈣礦化上述制得的具有自礦化能力的疫苗的方法；(1)向有酸根的疫苗液加入Ca2+離子；(2)將體系進(jìn)行孵育，獲得磷酸鈣包被疫苗。本發(fā)明通過疫苗礦化，高效地解決了疫苗運(yùn)輸和保存中的熱失活現(xiàn)象，顯著降低疫苗的財(cái)政支出，在新型熱穩(wěn)定疫苗生產(chǎn)中有很好的應(yīng)用。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是臨床最常見的高致殘性自身免疫病之一，以慢性破壞性關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕卣鳎⑸婕叭矶鄠€(gè)臟器。在我國，RA患病率為0.28%，患病人數(shù)500萬以上，診誤診誤治率高達(dá)42.5%，未經(jīng)治療者 3 年致殘率高達(dá)75%，是導(dǎo)致肢體殘疾，尤其是女性致殘的首要疾病，嚴(yán)重影響家庭、經(jīng)濟(jì)發(fā)展以及社會(huì)和諧。 目前臨床常用的RA治療藥物多為對癥治療，患者需要聯(lián)合用藥、終身服藥。這些藥物或存在副作用，或存在價(jià)格昂貴，患者負(fù)擔(dān)重，給藥途徑受限以及個(gè)體反應(yīng)差別大等問題。開發(fā)更加安全、有效、費(fèi)用較低的新藥是目前臨床亟待解決的問題。B細(xì)胞在RA發(fā)病中發(fā)揮重要作用，靶向清除B細(xì)胞在RA治療中取得了重大臨床成功，但患者面臨感染、疫苗接種無應(yīng)答等風(fēng)險(xiǎn)。 在此基礎(chǔ)上，本團(tuán)隊(duì)通過分離并進(jìn)一步滅活RA致病性B細(xì)胞，開創(chuàng)性研發(fā)了一種B細(xì)胞治療性疫苗，用于皮下注射治療RA。結(jié)果顯示，該B細(xì)胞疫苗在關(guān)節(jié)炎模型小鼠中顯示了顯著的治療效果，可有效控制關(guān)節(jié)炎癥狀，減輕骨侵蝕及關(guān)節(jié)破壞。此外，該B細(xì)胞疫苗對RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞也展示了明顯的抑炎活性，可以降低炎性細(xì)胞因子IFN-γ和IL-17A的分泌。

創(chuàng)制出了一種基于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)的血清 4 型禽腺病毒滅活苗。通過懸浮培養(yǎng)技術(shù)，該血清 4 型禽腺病毒效價(jià)可達(dá)到 109 TCID50/ml，是傳統(tǒng)雞胚培養(yǎng)獲得的病毒效價(jià)的 100 倍。動(dòng)物免疫效果表明，免疫后 21 天攻毒，非免疫對照組雞均全部死亡，觀察期內(nèi)發(fā)病雞多表現(xiàn)精神沉郁、羽毛粗亂、食欲不振，剖檢可見心包積液、肝臟病變等相關(guān)組織病變；免疫組均為 100%保護(hù)，觀察期內(nèi)未見任何異常現(xiàn)象，剖檢未見腺病毒相關(guān)組織病變。高效價(jià)血清 4 型禽腺病毒滅活苗的研制可大大降低疫苗的成本，提供疫苗免疫效果，具

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，PCV2廣泛分布于世界各地。迄今，世界范圍內(nèi)只有滅活疫苗可資利用，尚無活疫苗面市。研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用基因工程技術(shù)，研制成功嵌合型豬圓環(huán)病毒活疫苗（C1-233株），該疫苗病毒的滴度、安全性、免疫效力等關(guān)鍵指標(biāo)優(yōu)于國外相應(yīng)的文獻(xiàn)報(bào)道（國內(nèi)外無相應(yīng)產(chǎn)品面市，無法與其產(chǎn)品對照）。該疫苗的制苗毒株應(yīng)用自主建立的毒株構(gòu)建方法制備，制苗毒株由研究團(tuán)隊(duì)自行分離鑒定，具有完全的自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)。基于實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，研制的嵌合型豬圓環(huán)病毒活疫苗（C1-233株）免疫效

圓環(huán)病毒 2 型（PCV2）嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展， PCV2 廣泛分布于世界各地。迄今，世界范圍內(nèi)只有滅活疫苗可資利用，尚無活疫苗面市。研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用基因工程技術(shù)，研制成功嵌合型豬圓環(huán)病毒活疫苗（C1-233 株），該疫苗病毒的滴度、安全性、免疫效力等關(guān)鍵指標(biāo)優(yōu)于國外相應(yīng)的文獻(xiàn)報(bào)道（國內(nèi)外無相應(yīng)產(chǎn)品面市，無法與其產(chǎn)品對照）。該疫苗的制苗毒株應(yīng)用自主建立的毒株構(gòu)建方法制備，制苗毒株由研究團(tuán)隊(duì)自行分離鑒定，具有完全的自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)。基于實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，研制的嵌合型豬圓環(huán)病毒活疫苗（C1-233

針對病毒結(jié)構(gòu)多樣、快速變異的特征，周德敏課題組建立了病毒轉(zhuǎn)化為活疫苗的通用方法：在保留病毒感染情況下，突變其一個(gè)三聯(lián)碼為終止密碼，病毒就變?yōu)轭A(yù)防性疫苗，突變多個(gè)三聯(lián)碼病毒 就變?yōu)橹委熜运幬铮嵏膊《疽呙缪邪l(fā)理念。

多肽水凝膠具有生物相容性高、可降解、具有生物活性等特點(diǎn)和 優(yōu)點(diǎn)，它在生長因子和藥物的緩控釋、組織工程和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具 有很高的應(yīng)用前景。目前有較高轉(zhuǎn)化前景的項(xiàng)目是多肽水凝膠在疫苗 佐劑和抗體制備方面的應(yīng)用。癌癥、艾滋病、丙肝等重大疾病疫苗的 研制具有重要的意義。在這些疾病的預(yù)防性和治療性疫苗研制中，關(guān) 鍵的一環(huán)是可激活人體細(xì)胞免疫的佐劑的發(fā)現(xiàn)。 本項(xiàng)目開發(fā)出一種多肽水凝膠，具有極強(qiáng)地激發(fā)細(xì)胞免疫的功能。 對比于現(xiàn)有的幾種可激活細(xì)胞免疫的佐劑（CpG，MPL 等），我們的 水凝膠佐劑具有以下優(yōu)勢： 1）成本低，1mgCpG 價(jià)格為 5000-8000rmb，1mgMPL 價(jià)格為 2000- 4000rmb，我們的短肽實(shí)驗(yàn)室合成成本 1g 低于 500rmb； 2）操作簡單，僅需物理混合就可實(shí)現(xiàn)與抗原復(fù)合； 3）適用于蛋白、短肽、DNA、滅活癌細(xì)胞等各類抗原，通用性 高； 4）短肽結(jié)構(gòu)簡單，可大量制備，實(shí)驗(yàn)室一天內(nèi)一次性即可合成10g 以上該多肽，可用于制備 10000 瓶以上 1mL 的水凝膠（臨床用的 疫苗每次注射量是 0.5-1mL），可以很容易的實(shí)現(xiàn)中試級(jí)別的化合物 合成及疫苗制備。基于這些優(yōu)點(diǎn)，該佐劑具有極強(qiáng)的應(yīng)用前景，該研 究獲得科技部重大國際合作項(xiàng)目資助。 由于本項(xiàng)目的水凝膠可制備短肽抗原的抗體，它在抗體定制中具 有極高的應(yīng)用前景。目前抗體制備的技術(shù)為第一步將短肽連接到載體 蛋白 BSA、KLH 等上，然后打動(dòng)物 6-10 周。現(xiàn)有技術(shù)操作復(fù)雜（需 偶聯(lián)蛋白）、耗時(shí)長（6-10 周），而且很多時(shí)候還未能產(chǎn)生有效的抗體。 我們想發(fā)展的技術(shù)相比于現(xiàn)有技術(shù)來說具有明顯的優(yōu)勢：操作簡單， 僅需物理混合短肽抗原；抗體產(chǎn)生迅速，4-6 周即能生成抗體；抗體 滴度高，由于無需使用載體蛋白，短肽的特異性抗體滴度更高；對于 磷酸化抗體來說，本項(xiàng)目的水凝膠能減少磷酸化短肽被體內(nèi)磷酸酶去 磷酸化，從而提高磷酸化短肽抗體的比例。 

研發(fā)階段/n口蹄疫（FMD）是引起的人及偶蹄動(dòng)物共患的一種烈急性、高度接觸性、發(fā)熱性傳染病。FMD在世界上許多國家流行，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失和政治影響。口蹄疫病毒（FMDV）屬于小RNA病毒科（Picornaviridae），口蹄疫病毒屬（Aphthovirus），該病毒為單股正鏈小RNA病毒，基因組長約8500個(gè)核苷酸，主要由結(jié)構(gòu)基因（P1區(qū)）和非結(jié)構(gòu)基因（P2、P3區(qū)）等構(gòu)成。該發(fā)明具體涉及一種新的含有口蹄疫病毒主要免疫原性基因的重組偽狂犬病弱毒疫苗株，該毒株屬于豬偽狂犬病毒：Pseudorabi