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磷脂酶 D 是一種用于磷脂改性的工業(yè)化生產(chǎn)用酶，近年來(lái)研究較多且效果比較明顯的是通過(guò)微生物發(fā)酵的方法獲得磷脂酶 D。磷脂酶 D 主要用于兩個(gè)方面：一是從卵磷脂出發(fā)，通過(guò)磷酸基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，制備含量較少的磷脂化合物，如磷脂酰絲氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）等；二是通過(guò)轉(zhuǎn)移反應(yīng)合成新的磷脂衍生物，用在藥物學(xué)領(lǐng)域。磷脂酰絲氨酸是磷脂中的一種，天然含量稀少，但它是大腦中主要的酸性磷脂，能控制和調(diào)節(jié)細(xì)胞膜關(guān)鍵蛋白的功能狀態(tài)，提高腦細(xì)胞的活力，改善大腦功能、修復(fù)大腦損傷，成為“腦專一性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)”。本項(xiàng)目通過(guò)菌種篩選獲得一株高產(chǎn)磷脂酶 D 的肉桂鏈霉菌菌株。通過(guò)發(fā)酵優(yōu)化，發(fā)酵酶活可達(dá)到 10U/mL 以上，可用于 PS、PI 的生產(chǎn)。 

本成果從一株高產(chǎn) L-異亮氨酸的 C. glutamicum 出發(fā)，運(yùn)用反向代謝工程策略對(duì)其代謝通路進(jìn)行理性重排，以期實(shí)現(xiàn) L-蘇氨酸高產(chǎn)，特別是近期，通過(guò)熱誘導(dǎo)丙酮酸羧化酶和蘇氨酸外排泵創(chuàng)蘇氨酸產(chǎn)率紀(jì)錄，開發(fā)了一種兩段式溫控發(fā)酵蘇氨酸的重組大腸桿菌和工藝，發(fā)酵罐蘇氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá) 103.28%。這套復(fù) 雜中心代謝途徑的自我調(diào)控維持了生產(chǎn)和生長(zhǎng)的平衡。論文用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的一株產(chǎn)蘇氨酸的重組大腸桿菌 TWF001 為宿主，首先編輯了涉及副產(chǎn)物有機(jī)酸合成、產(chǎn)物降解和轉(zhuǎn)運(yùn)的基因，并證實(shí)這一系列菌種在 37 度升至 42 度情況下的生長(zhǎng)情況等同正常 37 度發(fā)酵；然后用一套大腸桿菌熱敏啟動(dòng)子去轉(zhuǎn)錄四環(huán)素啟動(dòng)子阻遏蛋白，四環(huán)素啟動(dòng)子后的報(bào)告基因 37 度表達(dá)，42 度不表達(dá)。 

利用自主篩選、鑒定和保藏的一株產(chǎn)精氨酸脫亞氨基酶（ADI）的惡臭假單胞菌 CGMCC1347，通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)其微生物細(xì)胞，用于轉(zhuǎn)化精氨酸生成 L-瓜氨酸，用 5L 發(fā)酵罐發(fā)酵 20 小時(shí)產(chǎn)酶活力達(dá)到 2.17U/mL。采用卡拉膠等凝膠包埋固定化細(xì)胞反復(fù)分批轉(zhuǎn)化 10 次，酶活力不減。用固定化細(xì)胞固定床反應(yīng)器進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)化，連續(xù) 30 天以上，連續(xù) 30 天 mol 轉(zhuǎn)化率穩(wěn)定在 90-99％，30 天平均稀釋速率 D=0.0735 h-1，固定床反應(yīng)器生產(chǎn)效率平均 6.34 g L-1 h-1，固定化細(xì)胞生產(chǎn)能力 0.0108 g h-1 g -1。本技術(shù)的特點(diǎn)是高產(chǎn)精氨酸脫亞氨基酶（ADI）的惡臭假單胞菌菌株能高效轉(zhuǎn)化精氨酸生成 L-瓜氨酸，對(duì)底物總摩爾轉(zhuǎn)化率高，轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物純度高，作為生物催化劑的微生物細(xì)胞易于培養(yǎng)且安全無(wú)毒，生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好。固定化細(xì)胞可反復(fù)利用多次，或裝柱連續(xù)轉(zhuǎn)化。 

精氨酸脫亞胺酶（Arginine deiminase，EC 3.5.3.6，ADI）因其可以作為 精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型腫瘤細(xì)胞（如：肝癌、黑素瘤）的靶向治療藥物而受到廣泛關(guān)注。目前，進(jìn)入癌癥臨床研究的僅有支原體來(lái)源的 ADI，處于臨床三期試驗(yàn)。本項(xiàng)目從自然界篩選到產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶的變形假單胞菌，在大腸桿菌實(shí)現(xiàn) 了該酶的重組表達(dá)，采用該重組 ADI 進(jìn)行體外和小鼠體內(nèi)抗癌活性研究，對(duì)肝癌細(xì)胞人肝癌細(xì)胞系 HepG2 和小鼠肝癌細(xì)胞系 H22 有顯著抑制作用。基于簡(jiǎn)便靈敏的 96 孔板高通量篩選模型，篩選在體內(nèi)生理?xiàng)l件下具有較高酶活以及底物親和性的精氨酸脫亞胺酶突變株，采用隨機(jī)突變、定點(diǎn)突變等非理性和半理性的蛋白質(zhì)定向進(jìn)化手段，獲得了最適 pH 由 6.0 提高至 7.0，在生理中性條件下（pH 7.4）酶活力較野生型 ADI 提高了 33 倍以上的 ADI 突變株，比活力為 15－17 U/mg。該改造后的 ADI 的 PEG 化和小鼠實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。 

中試階段/n成果簡(jiǎn)介：目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)減肥增效、節(jié)能降耗、減少環(huán)境污染是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。聚γ-谷氨酸（簡(jiǎn)稱“γ-PGA”）作為一種綠色生物大分子材料，不僅可使作物增產(chǎn)10-30％，節(jié)肥10-20％，還可提高作物品質(zhì)和作物抗病耐旱能力。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室率先在國(guó)際上開展了γ-PGA在農(nóng)作物栽培中的應(yīng)用，已申請(qǐng)γ-PGA發(fā)酵及γ-PGA在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用等5項(xiàng)中國(guó)發(fā)明專利，其中獲得3項(xiàng)發(fā)明專利授權(quán)。三項(xiàng)相關(guān)課題鑒定成果分別于2007年，2008年，2009年通過(guò)湖北省科技廳組織的專家鑒定

本項(xiàng)目首先借助比較蛋白組學(xué)研究技術(shù)，從細(xì)胞內(nèi)異亮氨酸合成及轉(zhuǎn)運(yùn)的整體網(wǎng)絡(luò)入手，揭示其中影響氨基酸胞外積累的若干關(guān)鍵蛋白質(zhì)，研究氨基酸合成及轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝調(diào)控、底物利用、細(xì)胞通透等相關(guān)蛋白質(zhì)的作用機(jī)制。然后采用系統(tǒng)生物學(xué)和代謝工程研究手段，利用啟動(dòng)子改造、基因共表達(dá)、酶定向進(jìn)化等技 術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)改造，以顯著提高乳糖發(fā)酵短桿菌支鏈氨基酸生產(chǎn)水平。比較蛋白組學(xué)分析將為支鏈氨基酸高產(chǎn)機(jī)理研究奠定堅(jiān)實(shí)理論基礎(chǔ)，乳糖發(fā)酵短桿菌代謝工程系統(tǒng)改造為工業(yè)化應(yīng)用提供有力技術(shù)支撐。 關(guān)鍵技術(shù) L-異亮氨酸是人體 8 種必需氨基酸之一，因其具特殊的結(jié)構(gòu)和功能，其用量逐年增長(zhǎng)，目前國(guó)際上日本生產(chǎn) L-異亮氨酸且占?jí)艛嗟匚唬瑥S家有味之素、協(xié)和發(fā)酵和田邊制藥三家，均已發(fā)酵法生產(chǎn)，產(chǎn)率達(dá) 30-35 g/L，提取率 60-70%，我國(guó)的異亮氨酸研究起步晚，目前分批發(fā)酵大罐產(chǎn)酸率為 20-22g/L，總得率為 40- 50%，與日本相比較，我國(guó)的 L-異亮氨酸生產(chǎn)水平還很低下，主要是由于生產(chǎn)菌株絕大多數(shù)通過(guò)誘變選育獲得，少數(shù)菌株利用基因工程手段改造，但僅局限于少數(shù)合成酶基因，這嚴(yán)重制約了支鏈氨基酸產(chǎn)率的進(jìn)一步提高。本成果克服了行業(yè)內(nèi)的菌株瓶頸，并優(yōu)化獲得了工業(yè)發(fā)酵工藝。

成果描述：甘氨酸螯合鐵是一種新型的鐵強(qiáng)化劑，具有穩(wěn)定性適中，吸收率高，生物效價(jià)高，雙重營(yíng)養(yǎng)，安全性高等特點(diǎn)。但是目前我國(guó)對(duì)氨基酸螯合鐵的研究不深入，合成、檢測(cè)技術(shù)不成熟。國(guó)內(nèi)用于營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑的螯合鐵一般是從國(guó)外進(jìn)口，成本高，并且無(wú)法獲得國(guó)外生產(chǎn)廠家的合成及檢測(cè)技術(shù)，給生產(chǎn)、加工、貯藏過(guò)程中產(chǎn)品的質(zhì)量控制帶來(lái)了許多困難。我們研究了甘氨酸螯合鐵的合成工藝。通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)，以產(chǎn)物的重量，產(chǎn)物中鐵和亞鐵含量，鐵和亞鐵的得率為指標(biāo)，確定了下面合成條件適宜值：配位比（甘氨酸:：鐵），反應(yīng)物濃度、反應(yīng)溶液，pH值，反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間，乙醇用量倍，抗氧化劑（鐵粉）用量。我們對(duì)用最優(yōu)工藝制備出的產(chǎn)物進(jìn)行了分析，并與SKP, CMC, Albion, 地奧四家公司的甘氨酸螯合鐵商品進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果顯示，自制的甘氨酸螯合鐵的總鐵含量和亞鐵含量基本達(dá)到商品氨基酸螯合鐵的水平，達(dá)到了功能性食品添加劑原料的標(biāo)準(zhǔn)。市場(chǎng)前景分析：保健食品市場(chǎng)。與同類成果相比的優(yōu)勢(shì)分析：符合中國(guó)衛(wèi)生部關(guān)于保健食品的原料要求，產(chǎn)品的衛(wèi)生指標(biāo)、理化指標(biāo)、功效成分指標(biāo)和安全性指標(biāo)等均符合衛(wèi)生部關(guān)于保健食品的相關(guān)要求。

微生物合成的γ-聚谷氨酸為均聚氨基酸化合物，分子量在100－1000kDa之間，相當(dāng)于500－5000個(gè)左右的谷氨酸單體，具有優(yōu)良的成膜性、成纖維性、阻氧性、可塑性、粘結(jié)性和極其強(qiáng)的吸水性，從而在高分子材料工程中具有增稠、乳化、凝膠、成膜、保溫、緩釋、助溶、粘結(jié)和強(qiáng)吸水等功能。作為一種生物材料，γ-PGA又具有生物可降解性好、可食、對(duì)人體和環(huán)境無(wú)毒害等優(yōu)點(diǎn)，因而在食品、化妝品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和水處理等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。南開大學(xué)專利技術(shù)：一種提高水溶性高聚物發(fā)酵產(chǎn)率的方法（公開號(hào)： CN1

該研究鑒定到一個(gè)新的小麥條銹菌富含甘氨酸/絲氨酸效應(yīng)子PstGSRE4，揭示其通過(guò)靶向小麥抗病相關(guān)蛋白銅鋅超氧化物歧化酶TaCZSOD2抑制植物免疫的分子機(jī)理。

本研究構(gòu)建一種谷氨酸棒桿菌基因工程菌，使其同時(shí)發(fā)酵生產(chǎn)兩種產(chǎn)品：聚羥基脂肪酸酯和異亮氨酸；前者是胞內(nèi)產(chǎn)品，后者是胞外產(chǎn)品。該基因工程菌可以降低生產(chǎn)成本，具有工業(yè)應(yīng)用前景。研究結(jié)果顯示：將 phaCAB 基因簇導(dǎo)入 WM001后，WM001/pDXW-8-phaCAB 96h 產(chǎn)量為 9.58 g/L，而 WM001/pDXW-8 96h 產(chǎn)量為6.65 g/L，產(chǎn)率提高 65%達(dá)到 0.15g 異亮氨酸/g 葡萄糖。PHA 產(chǎn)量達(dá)到 28.7%(w/w)。關(guān)鍵技術(shù) 聚羥基脂肪酸酯（PHAs）是部分微生物生存在具有較高碳源與氮源的條件下，生成的一類微生物自身碳源、能源儲(chǔ)備物的胞內(nèi)聚酯。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，將 PHB 合成代謝基因簇導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，可實(shí)現(xiàn) PHB 與某些代謝產(chǎn)物的聯(lián)產(chǎn)和增產(chǎn)，提高底物的利用率。L-異亮氨酸是一種人體必需氨基酸，因其在醫(yī)藥、食品和健康保健領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，而使其近幾年的生產(chǎn)能力發(fā)展迅速，目前國(guó)際上比較先進(jìn)的主流生產(chǎn)方式為發(fā)酵法生產(chǎn) L-異亮氨酸。谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是一種小棒狀、革蘭氏陽(yáng)性的食品安全生產(chǎn)菌，目前已經(jīng)用于工業(yè)生產(chǎn) L-異亮氨酸，本成果構(gòu)建能高產(chǎn) PHAs 的 C. glutamicum 菌株，具有工業(yè)化應(yīng)用潛力。