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本發明公開一種制備熱穩定疫苗的方法，特別涉及一種聯合使用基因工程和仿生礦化技術制備熱穩定疫苗的方法。本發明提供一種利用基因工程技術在疫苗表面引入具有誘導無機物礦化能力的多肽的方法；(1)構建疫苗的基因克隆；(2)將多肽的核酸序列插入疫苗基因克隆中，得到重組克隆；(3)將重組克隆在細胞或大腸桿菌內表達，得到具有自礦化能力的疫苗。本發明還一種制備鈣礦化上述制得的具有自礦化能力的疫苗的方法；(1)向有酸根的疫苗液加入Ca2+離子；(2)將體系進行孵育，獲得磷酸鈣包被疫苗。本發明通過疫苗礦化，高效地解決了疫苗運輸和保存中的熱失活現象，顯著降低疫苗的財政支出，在新型熱穩定疫苗生產中有很好的應用。

類風濕關節炎（RA）是臨床最常見的高致殘性自身免疫病之一，以慢性破壞性關節病變為主要特征，并涉及全身多個臟器。在我國，RA患病率為0.28%，患病人數500萬以上，診誤診誤治率高達42.5%，未經治療者 3 年致殘率高達75%，是導致肢體殘疾，尤其是女性致殘的首要疾病，嚴重影響家庭、經濟發展以及社會和諧。 目前臨床常用的RA治療藥物多為對癥治療，患者需要聯合用藥、終身服藥。這些藥物或存在副作用，或存在價格昂貴，患者負擔重，給藥途徑受限以及個體反應差別大等問題。開發更加安全、有效、費用較低的新藥是目前臨床亟待解決的問題。B細胞在RA發病中發揮重要作用，靶向清除B細胞在RA治療中取得了重大臨床成功，但患者面臨感染、疫苗接種無應答等風險。 在此基礎上，本團隊通過分離并進一步滅活RA致病性B細胞，開創性研發了一種B細胞治療性疫苗，用于皮下注射治療RA。結果顯示，該B細胞疫苗在關節炎模型小鼠中顯示了顯著的治療效果，可有效控制關節炎癥狀，減輕骨侵蝕及關節破壞。此外，該B細胞疫苗對RA患者外周血單個核細胞也展示了明顯的抑炎活性，可以降低炎性細胞因子IFN-γ和IL-17A的分泌。

多肽水凝膠具有生物相容性高、可降解、具有生物活性等特點和 優點，它在生長因子和藥物的緩控釋、組織工程和再生醫學等領域具 有很高的應用前景。目前有較高轉化前景的項目是多肽水凝膠在疫苗 佐劑和抗體制備方面的應用。癌癥、艾滋病、丙肝等重大疾病疫苗的 研制具有重要的意義。在這些疾病的預防性和治療性疫苗研制中，關 鍵的一環是可激活人體細胞免疫的佐劑的發現。 本項目開發出一種多肽水凝膠，具有極強地激發細胞免疫的功能。 對比于現有的幾種可激活細胞免疫的佐劑（CpG，MPL 等），我們的 水凝膠佐劑具有以下優勢： 1）成本低，1mgCpG 價格為 5000-8000rmb，1mgMPL 價格為 2000- 4000rmb，我們的短肽實驗室合成成本 1g 低于 500rmb； 2）操作簡單，僅需物理混合就可實現與抗原復合； 3）適用于蛋白、短肽、DNA、滅活癌細胞等各類抗原，通用性 高； 4）短肽結構簡單，可大量制備，實驗室一天內一次性即可合成10g 以上該多肽，可用于制備 10000 瓶以上 1mL 的水凝膠（臨床用的 疫苗每次注射量是 0.5-1mL），可以很容易的實現中試級別的化合物 合成及疫苗制備。基于這些優點，該佐劑具有極強的應用前景，該研 究獲得科技部重大國際合作項目資助。 由于本項目的水凝膠可制備短肽抗原的抗體，它在抗體定制中具 有極高的應用前景。目前抗體制備的技術為第一步將短肽連接到載體 蛋白 BSA、KLH 等上，然后打動物 6-10 周。現有技術操作復雜（需 偶聯蛋白）、耗時長（6-10 周），而且很多時候還未能產生有效的抗體。 我們想發展的技術相比于現有技術來說具有明顯的優勢：操作簡單， 僅需物理混合短肽抗原；抗體產生迅速，4-6 周即能生成抗體；抗體 滴度高，由于無需使用載體蛋白，短肽的特異性抗體滴度更高；對于 磷酸化抗體來說，本項目的水凝膠能減少磷酸化短肽被體內磷酸酶去 磷酸化，從而提高磷酸化短肽抗體的比例。 

“NMT界喬布斯”許越先生推薦創新平臺 中關村NMT產業聯盟推介成員單位創新產品 “生物安全，人人有責” 推出背景： 在國際競爭白熱化，戰爭形態多樣化的今天，生物安全已成為國家安全的重要組成部分，為積極應對這一挑戰，2019年10月，生物安全法草案于首次提請十三屆全國人大常委會第十四次會議審議。本次新冠肺炎疫情的爆發，讓各界更加意識到，生物安全對于確保國家安全、保障社會穩定、人民群眾生命安全和身體健康的重要性。 國家安全就是國家競爭，歸根結底又是科技實力的競爭！因此，作為中國的高新技術企業，中關村NMT聯盟的會員單位，旭月（北京）科技有限公司利用20多年的技術積累，以NMT：非損傷微測技術為底層核心技術，迅速推出了與國家生物安全相關多種檢驗，監測儀器設備，以及適用于多個學科及領域的研發平臺： 《NMT生物安全創新平臺》特制系列產品！ ? 應對挑戰： 1）有效性：隨著研究的深入，單細胞的生理狀態，以及對疫苗的生理反應，與處于機體組織器官中的細胞的差異，已逐漸成為研究中的瓶頸。NMT不僅可以檢測單細胞，還可以實現對細胞的原位檢測，以及對活體組織的在體檢測，很好地彌補了這一研究手段的空白。 2）安全性：NMT是用于研究活體材料的生理環境，其所檢測的Na+、H+、K+、Cl-等與細胞能量代謝、細胞凋亡、細胞形態維持等生理過程直接相關。 分類及用途： 1）《抗菌疫苗研究NMT工作站 》（型號：NMT-ABR-100） 基于底層核心NMT技術，以及成熟的技術解決方案，讓科研人員可以馬上投入相關科研創新工作。 ? 2）《抗菌疫苗研究NMT工作站》（型號：NMT-ABR-200） 基于底層核心NMT技術，結合自身科研興趣，以及其它相關技術參數，在我方技術人員協助下形成技術解決方案，讓科研人員建立更具獨有創新特色的實驗平臺。 ? 《抗菌疫苗研究NMT工作站》（型號：NMT-ABR-100） 應對挑戰： 1）有效性：隨著研究的深入，單細胞的生理狀態，以及對疫苗的生理反應，與處于機體組織器官中的細胞的差異，已逐漸成為研究中的瓶頸。NMT不僅可以檢測單細胞，還可以實現對細胞的原位檢測，以及對活體組織的在體檢測，很好地彌補了這一研究手段的空白。 2）安全性：NMT是用于研究活體材料的生理環境，其所檢測的Na+、H+、K+、Cl-等與細胞能量代謝、細胞凋亡、細胞形態維持等生理過程直接相關。 用途： 基于底層核心NMT技術，以及成熟的技術解決方案，讓科研人員可以馬上投入相關科研創新工作。 ? 參數： 1.基本功能： 1.1針對抗菌疫苗研究設計 1.2活體、原位、非損傷檢測 1.3可檢測指標：H+、K+、Ca2+、Cl-、O2 2.性能： 2.1自動化操作 2.2長時間實時和動態監測 2.3無需標記 2.4立體3D流速檢測 3.軟件： 3.1imFluxes智能軟件，可直接檢測、輸出離子分子的濃度與流速 《抗菌疫苗研究NMT工作站》（型號：NMT-ABR-200） 應對挑戰： 1）有效性：隨著研究的深入，單細胞的生理狀態，以及對疫苗的生理反應，與處于機體組織器官中的細胞的差異，已逐漸成為研究中的瓶頸。NMT不僅可以檢測單細胞，還可以實現對細胞的原位檢測，以及對活體組織的在體檢測，很好地彌補了這一研究手段的空白。 2）安全性：NMT是用于研究活體材料的生理環境，其所檢測的Na+、H+、K+、Cl-等與細胞能量代謝、細胞凋亡、細胞形態維持等生理過程直接相關。 用途： 基于底層核心NMT技術，結合自身科研興趣，以及其它相關技術參數，在我方技術人員協助下形成技術解決方案，讓科研人員建立更具獨有創新特色的實驗平臺。 ? 參數： 1.基本功能： 1.1針對抗菌疫苗研究和研發設計 1.2活體、原位、非損傷檢測 1.3可檢測指標：H+、K+、Ca2+、Cl-、O2 1.4可實時監測和記錄檢測時的環境參數：溫度、濕度、大氣壓、海拔、經緯度 1.5配備新指標拓展功能 2.性能： 2.1自動化操作 2.2長時間實時和動態監測 2.3無需標記 2.4立體3D流速檢測 3.軟件： 3.1imFluxes智能軟件，可直接檢測、輸出離子分子的濃度與流速，以及檢測時的環境參數

本工作成果構建了新型可離子化脂質分子庫，可通過排列組合形成數十個新型可離子化脂質，已掌握脂質納米顆粒構建的核心技術。 一、項目分類 關鍵核心技術突破 二、技術分析 相對傳統疫苗（如滅活疫苗、重組蛋白疫苗等），mRNA 疫苗具有應變能力快、制備簡單、免疫效力強等特點，在控制病毒傳染性疾病中具有至關重要的作用。脂質納米顆粒（LNP）是介導mRNA在人體內發揮功能的最優解。Pfizer和Moderna公司構建的LNP依然被認為是“best-in-class”的mRNA疫苗遞送技術。其中關鍵組分雙親性可離子化脂質的合理設計可達到mRNA有效遞送和釋放。但脂質納米顆粒核心技術專利集中于少數國外公司如Arbutus、Moderna、CureVac和BioNtech，專利壁壘高。目前，我國沒有自主研發的高效并安全的用于人體的mRNA遞送系統，致使歐美可隨時限制我國的mRNA疫苗生產。 本工作成果構建了新型可離子化脂質分子庫，可通過排列組合形成數十個新型可離子化脂質，已掌握脂質納米顆粒構建的核心技術。目前已成功合成并進行活性驗證的新型可離子化脂質4個。其中，脂質A1-D1-5的活性最佳，基于其制備的LNP不但成功地載荷小干擾RNA在小鼠體內有效地治療了代謝疾病，還實現了高效的mRNA負載和體內遞送。代謝疾病的治療成果發表在國際學術期刊Science Advances上，mRNA負載系統已經與多家公司開展合作進行臨床前開發工作。

本發明的目的是提供一種鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗，即采用生物技術對鴨坦布蘇病毒E蛋白進行抗原表位分析、拼接，獲得一種鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白DE，并以該融合蛋白作為抗原來制備鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗。本發明中鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白DE，其編碼蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:1；其中一種核苷酸序列為SEQ ID NO:2。本發明利用pET28a（+）表達性載體構建了能表達鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白DE的大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌。將重組表達的蛋白純化后制備成基因工程亞單位疫苗，可使免疫后鴨群獲得免疫保護。

本發明涉及一種利用噬菌體PhiX174的E基因和葡萄球菌核酸酶A基因轉化制備鴨疫里默氏菌前菌影疫苗的方法與應用方法。該方案首先將噬菌體PhiX174的E基因和葡萄球菌核酸酶A基因通過柔性連接臂(Gly4Ser)3連接成串聯基因，并進一步構建溫控表達載體pBV-E-SN。將pBV-E-SN電擊轉化進入鴨疫里默氏菌原生質體，篩選陽性克隆28℃增菌培養。分離菌體加保護劑后分裝、冷凍干燥。本發明所制備的活菌疫苗經飲水免疫，既可以刺激呼吸道和消化道黏膜的局部免疫，也可以激發體液免疫。

本產品為增強黏膜免疫的口服活載體疫苗，是新一代預防和治療乳仔豬腹瀉的特異 性免疫微生態制劑。主要成分為活菌乳酸重組菌，活菌總數≥3.5×109cfu/g，同時也 含有死菌以及代謝產物。活菌進入機體后可定植在腸壁，通過生長繁殖，產生的乳酸和 乙酸，降低了腸道的PH及Eh值，改善內部微環境，能抑制有害菌的生長，其代謝產物對 機體有營養作用，促進免疫功能的作用。 該乳酸重組菌可促進腸道有益菌落生長繁殖，拮抗和抑制腸道內有害菌增殖，糾正 腸道菌群紊亂，產生特異性抗體，預防和治療豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉等病毒引起 的腹瀉、下痢、細菌性腸炎等疾病，增強免疫力和抗病力。

本產品為增強黏膜免疫的口服活載體疫苗，是新一代預防和治療乳仔豬腹瀉的特異性免疫微生態制劑。主要成分為活菌乳酸重組菌，活菌總數≥3.5×109cfu/g，同時也含有死菌以及代謝產物。活菌進入機體后可定植在腸壁，通過生長繁殖，產生的乳酸和乙酸，降低了腸道的PH及Eh值，改善內部微環境，能抑制有害菌的生長，其代謝產物對機體有營養作用，促進免疫功能的作用。 該乳酸重組菌可促進腸道有益菌落生長繁殖，拮抗和抑制腸道內有害菌增殖，糾正腸道菌群紊亂，產生特異性抗體，預防和治療豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉等病毒引起的腹瀉、下痢、細菌性腸炎等疾病，增強免疫力和抗病力。