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成果簡介： 近年來重金屬污染事件頻發(fā)，不僅嚴(yán)重阻礙經(jīng)濟(jì)社會的良性發(fā)展，而且對人體健康造成不可逆轉(zhuǎn)的損害。我國是人均耕地資源短缺的國家，水、大氣等受體的污染物最終將會陸續(xù)轉(zhuǎn)移到土壤中，為保證糧食安全問題，2016年國務(wù)院印發(fā)了《土壤污染防治行動計(jì)劃》，簡稱“土十條”。本成果針對中國日趨嚴(yán)重的土壤重金屬污染問題，開展土壤重金屬污染生物修復(fù)關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)與應(yīng)用示

針對不合理施用肥料及集約化生產(chǎn)等導(dǎo)致的土壤生物退化，土壤生態(tài)系統(tǒng)調(diào)控能力下降，植物土傳病害加劇等問題，開展了農(nóng)用功能微生物的篩選及其在農(nóng)業(yè)廢棄物肥料化、土壤微生態(tài)修復(fù)調(diào)理、植物抑病促生等方面的研究。研究獲得200多株對10余種主要農(nóng)作物土傳病原靶標(biāo)菌有較強(qiáng)防病促生優(yōu)良微生物菌株，開發(fā)出生防放線菌菌株3株、真菌1株、細(xì)菌2株。在此基礎(chǔ)上集成功能微生物高密度培養(yǎng)技術(shù)、土壤微生態(tài)系統(tǒng)的快速修復(fù)技術(shù)和微生物干預(yù)植物減害、生態(tài)友好技術(shù)。開發(fā)了放線菌高活性菌粉、放線菌有機(jī)肥和放線菌液體肥料等產(chǎn)品，并建立了相應(yīng)生產(chǎn)線。該成果既能實(shí)現(xiàn)土壤生物退化及連作障礙的微生物修復(fù)，又能實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)減肥減藥、產(chǎn)品提質(zhì)增效；該成果實(shí)施后預(yù)期年生產(chǎn)菌劑固態(tài)6000噸，每噸售價(jià)20000元；液態(tài)5000噸，每噸售價(jià)15000元。

通過微生物育種和基因工程手段相結(jié)合，獲得了一株脯氨酸高產(chǎn)菌株黃色短桿菌。發(fā)酵培養(yǎng) 65~68 h， L-脯氨酸產(chǎn)量高達(dá) 100 g/L，葡萄糖得率為 45%左右。 關(guān)鍵技術(shù) (1)本研究以玉米漿為氮源，有效的降低了發(fā)酵成本； (2)以葡萄糖和味精為原料生產(chǎn) L-脯氨酸的高轉(zhuǎn)化率發(fā)酵，該法綠色、環(huán)保、可持續(xù)，具有經(jīng)濟(jì)競爭力，有很好的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景。

結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研和數(shù)據(jù)庫檢索，選擇 L-氨基酸脫氨酶在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，對菌株進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化，并對野生型 L-氨基酸脫氨酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造，一定程度上減輕了產(chǎn)物抑制作用，產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率都有所提高。主要技術(shù)指標(biāo)：濕菌體 15g/L，底物 L-纈氨酸 100 g/L，α-酮異戊酸產(chǎn)量為 95.6 g/L，轉(zhuǎn)化率為 96.4%。 關(guān)鍵技術(shù) (1)以大腸桿菌為宿主，生長快，周期短，催化效率高； (2)對野生型 L-氨基酸脫氨酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造，一定程度上減輕了產(chǎn)物抑制作用，產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率都有所提高； (3)微生物轉(zhuǎn)化具有專一性強(qiáng)、條件溫和的優(yōu)點(diǎn)，該法綠色、環(huán)保、可持續(xù)，具有經(jīng)濟(jì)競爭力，有很好的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景。 

谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase , GAD)能專一地催化 L-谷氨酸裂解為γ-氨基丁酸和 CO2 的作用，以發(fā)酵培養(yǎng)的全細(xì)胞或酶液作為催化劑轉(zhuǎn)化生產(chǎn)γ-氨基丁酸，所需設(shè)備簡單，條件容易控制，轉(zhuǎn)化體系雜質(zhì)含量少，收率高，環(huán)境友好。本技術(shù)方法通過蛋白質(zhì)工程改造和基因工程手段構(gòu)建了高產(chǎn)谷氨酸脫 羧酶的突變株，經(jīng)培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)化體系中添加濕菌體 10 g/L，以分批補(bǔ)料添加谷氨酸，轉(zhuǎn)化 7 h，γ-氨基丁酸產(chǎn)量為 425.0 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到 98%，γ-氨基丁酸生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到 60.7 g/(L?h)。 關(guān)鍵技術(shù) (1) 以大腸桿菌為宿主，生長快，周期短，催化效率高； (2)以廉價(jià)的富馬酸為底物生產(chǎn)高附加值β-丙氨酸，成本低，收益高； (3)微生物轉(zhuǎn)化具有專一性強(qiáng)、條件溫和的優(yōu)點(diǎn)，該法綠色、環(huán)保、可持續(xù)， 具有經(jīng)濟(jì)競爭力，有很好的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景

浮游植物在表層獲取光能固定CO2，形成顆粒有機(jī)碳（POC）往下沉降，在深海再礦化后生成銨（NH4+），從而為深海化能自養(yǎng)細(xì)菌/古菌提供了能量來源。因此，氨氧化古菌和亞硝氧化細(xì)菌所介導(dǎo)的兩步硝化過程是實(shí)現(xiàn)光能傳遞到深海被利用的重要途徑，是深海重要的供能過程，支撐了海洋“黑暗固碳”——不依賴于光合作用的化能自養(yǎng)固碳，為深海生物圈提供了“新”的有機(jī)質(zhì)，同時積累硝氮。由于亞硝氧化菌群研究的長期滯后，氨氧化和亞硝氧化功能群在深海的協(xié)作關(guān)系始終不明了，因此國際上對深海硝化菌群支撐的碳（C）−氮（N）耦合機(jī)理（定性）的理解仍極為有限，對C−N計(jì)量學(xué)關(guān)系（定量）的準(zhǔn)確估算仍是空白。 該研究工作結(jié)合多組學(xué)分析、生理學(xué)實(shí)驗(yàn)、現(xiàn)場原位速率及動力學(xué)觀測和模擬，以及生態(tài)系統(tǒng)模型，闡釋了氨氧化古菌和亞硝氧化細(xì)菌顯著差異的代謝策略，及兩步氧化過程耦合、硝化與黑暗固碳耦合的生理生態(tài)學(xué)機(jī)制，建立了硝化菌群支撐的C−N、物質(zhì)與能量轉(zhuǎn)換的計(jì)量學(xué)關(guān)系，量化了深海硝化過程對深海生物圈及全球海洋碳循環(huán)的貢獻(xiàn)和影響。該工作為深海物質(zhì)與能量循環(huán)研究提供了新的參數(shù)，對深入認(rèn)識深海生物地球化學(xué)過程具有重要意義。

項(xiàng)目成果/簡介:浮游植物在表層獲取光能固定CO2，形成顆粒有機(jī)碳（POC）往下沉降，在深海再礦化后生成銨（NH4+），從而為深海化能自養(yǎng)細(xì)菌/古菌提供了能量來源。因此，氨氧化古菌和亞硝氧化細(xì)菌所介導(dǎo)的兩步硝化過程是實(shí)現(xiàn)光能傳遞到深海被利用的重要途徑，是深海重要的供能過程，支撐了海洋“黑暗固碳”——不依賴于光合作用的化能自養(yǎng)固碳，為深海生物圈提供了“新”的有機(jī)質(zhì)，同時積累硝氮。由于亞硝氧化菌群研究的長期滯后，氨氧化和亞硝氧化功能群在深海的協(xié)作關(guān)系始終不明了，因此國際上對深海硝化菌群支撐的碳（C）?氮（N）耦合機(jī)理（定性）的理解仍極為有限，對C?N計(jì)量學(xué)關(guān)系（定量）的準(zhǔn)確估算仍是空白。 該研究工作結(jié)合多組學(xué)分析、生理學(xué)實(shí)驗(yàn)、現(xiàn)場原位速率及動力學(xué)觀測和模擬，以及生態(tài)系統(tǒng)模型，闡釋了氨氧化古菌和亞硝氧化細(xì)菌顯著差異的代謝策略，及兩步氧化過程耦合、硝化與黑暗固碳耦合的生理生態(tài)學(xué)機(jī)制，建立了硝化菌群支撐的C?N、物質(zhì)與能量轉(zhuǎn)換的計(jì)量學(xué)關(guān)系，量化了深海硝化過程對深海生物圈及全球海洋碳循環(huán)的貢獻(xiàn)和影響。該工作為深海物質(zhì)與能量循環(huán)研究提供了新的參數(shù)，對深入認(rèn)識深海生物地球化學(xué)過程具有重要意義。

本成果總體達(dá)到同類研究的國際先進(jìn)水平，在獸醫(yī)微生物菌毒種資源規(guī)范性描述方 面處于國際領(lǐng)先水平，在獸醫(yī)微生物菌毒種資源的篩選和創(chuàng)新性應(yīng)用等方面處于國際先 進(jìn)水平。本成果于2009年獲得成果鑒定證書，獲得2010年度山東省科技進(jìn)步獎二等獎。 本成果分離鑒定了具有平臺資源號的280株細(xì)菌。其中，大腸桿菌80株，金黃色葡 萄球菌30株，豬鏈球菌50株，雞傷寒沙門氏菌103株，特殊菌株17株。分離鑒定了186株 病毒，其中NDV 60株，豬繁殖與呼吸綜合征病毒50株，犬瘟熱病毒3株，豬傳染性胃腸 炎病毒10株，豬流感病毒3株，禽流感病毒20株，雞傳染性支氣管炎病毒20株，雞傳染 性法氏囊病毒20株。對分離、收集和整理以前所保藏的菌毒種等方式獲得的33種3444株 菌毒種進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化整理整合，完成了相應(yīng)菌毒種種資源數(shù)據(jù)信息（包括個性信息和共性 信息）的采集、錄入、上報(bào)，完成280幅圖像信息采集、整理、上報(bào)，完成101株菌（毒） 種資源16SrRNA或病毒資源部分核酸序列的測定、上報(bào)。并向國家獸醫(yī)微生物菌種保藏 管理中心國家獸醫(yī)微生物標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏庫上交了1621株菌（毒）種，實(shí)現(xiàn)了獸醫(yī)微生物 菌毒種資源的信息及實(shí)物共享。起草了“布魯氏桿菌菌種資源描述規(guī)范”和“牛結(jié)核桿 菌資源檢測技術(shù)規(guī)程”，驗(yàn)證完善了“結(jié)核桿菌菌種資源檢測技術(shù)規(guī)程及試點(diǎn)應(yīng)用”等 9個獸醫(yī)微生物資源檢測技術(shù)規(guī)程。制定了“犬瘟熱診斷技術(shù)”的國家標(biāo)準(zhǔn)。對分離的 部分菌毒株進(jìn)行生物學(xué)特性研究，為相關(guān)單位的科學(xué)研究提供了優(yōu)良菌毒種。

威蘭膠是一種性能優(yōu)良的微生物多糖，性質(zhì)與黃原膠相似，同時存在同類多糖不可比擬的優(yōu)勢：1、在更大的范圍內(nèi)具有熱穩(wěn)定性，可以耐受150℃的高溫；2、pH耐受范圍廣，在pH2.0-13.0的范圍內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定；3、耐鹽性好。威蘭膠的耐溫特性在深層采油中十分重要，目前油井深度已達(dá)3000米以上，對采油驅(qū)動劑耐溫要求大于140℃，因此威蘭膠的耐溫優(yōu)勢以及它的一些獨(dú)特性能，使它有望成為一種性能更為優(yōu)良的驅(qū)油制劑。威蘭膠是一種不可多得的混凝土外加劑，可以增加水泥的可塑性，懸浮量，空氣含量，抗下陷能力以及抗失水性。威蘭膠是制備自密實(shí)混凝土和自流平混凝土不可缺少的添加劑。按每噸混凝土中添加0.01%的威蘭膠，則成本僅增加10塊錢左右。我國在這一領(lǐng)域的應(yīng)用全部依賴進(jìn)口。本課題組擁有一株自主知識產(chǎn)權(quán)的生產(chǎn)菌株，并率先在國內(nèi)開展了發(fā)酵法生產(chǎn)威蘭膠的研究。本項(xiàng)目的成功開發(fā)將具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)，對石油、混凝土等相關(guān)行業(yè)的發(fā)展具有積極的意義。威蘭膠的生產(chǎn)基本可以利用黃原膠的生產(chǎn)資源，因此實(shí)驗(yàn)室中試成熟后，廠家無需太多的前期投入就可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。

γ-聚谷氨酸（Poly-γ-glutamic acid）是一種重要的天然聚合物，由 于其具有良好的性質(zhì)已被廣泛應(yīng)用于食品，化妝品，醫(yī)藥，材料等領(lǐng) 域。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）LL3 是一株谷氨酸 非依賴型 γ-PGA 合成菌。為了提高其 γ-PGA 產(chǎn)量，項(xiàng)目組采用無痕 基因編輯技術(shù)對菌株進(jìn)行了代謝工程改造。包括三部分：模塊化代謝 通路改造；蔗糖代謝途徑改造；谷氨酸合成途徑改造。 B. amyloliquefaciens LL3 是項(xiàng)目組從發(fā)酵食品中分離得到，它能 夠從蔗糖出發(fā)合成 γ-PGA。利用模塊化通路改造策略對 γ-PGA 合成 相關(guān)的八個代謝通路進(jìn)行改造包括：γ-PGA 降解相關(guān)途徑；細(xì)胞呼吸 鏈；胞外蛋白及胞外蛋白酶合成途徑；細(xì)菌多糖合成途徑；次級小分 子代謝產(chǎn)物合成途徑；細(xì)胞自誘導(dǎo)因子合成途徑；谷氨酸合成途徑以 及 γ-PGA 合成途徑。最終整合獲得的最優(yōu)基因工程菌株 NK-anti-rocG （敲除了 epsA-O 操縱子（負(fù)責(zé)胞外多糖合成），sac 操縱子（負(fù)責(zé)果 聚糖合成），lps（脂多糖合成相關(guān)），pta（乙酸合成相關(guān)），pgdS（γ-PGA 降解酶），cwlO（細(xì)胞壁水解酶），luxS（AI-2 合成）以及表達(dá) anti-rocG sRNA（抑制谷氨酸脫氫酶表達(dá)））γ-PGA 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量從 3.8 g/L 提高到 11.04 g/L，較對照菌株提高了 2.91 倍。γ-PGA 產(chǎn)物純度也 從 78.6%提高到 95.2%。5-L 罐補(bǔ)料分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)得到 NK-anti-rocG 菌株產(chǎn)量可達(dá) 20.3 g/L。分子量 450,000 Dal，純度 95%以上。 項(xiàng)目特色： 1. 菌種（Bacillus amyloliquefaciens）LL3 是谷氨酸非依賴型 γ-聚谷 氨酸合成菌株；發(fā)酵生產(chǎn)主要原料為蔗糖； 2. 補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)量為：20.3 g/L。 3. 授權(quán)專利號為：ZL200810053900.7 市場應(yīng)用前景： γ-聚谷氨酸（Poly-γ-glutamic acid）是一種重要的天然聚合物，由 于其具有良好的性質(zhì)已被廣泛應(yīng)用于食品，化妝品，醫(yī)藥，材料等領(lǐng) 域。本項(xiàng)目采用谷氨酸非依賴型 γ-聚谷氨酸合成菌做為發(fā)酵菌種，以 蔗糖為原料發(fā)酵法生產(chǎn) γ-聚谷氨酸，可產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效 益。