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（ i ）能夠阻礙 DNA 聚合酶在反轉(zhuǎn)錄過程的單堿基延伸；（ ii ）能夠降低缺口連接酶的連接效率。 SELECT 方法采用熒光定量 PCR 的方法進(jìn)行定量。結(jié)合方法優(yōu)化，發(fā)展了 SELECT 方法的 3 個(gè)應(yīng)用實(shí)例：（ i ）在生物學(xué)樣本總 RNA 或總 mRNA 中檢測 mRNA 或 lncRNA 上單位點(diǎn)是否含有 m6A 修飾；（ ii ）檢測生物學(xué)樣本中特定 m6A 位點(diǎn)的修飾比例；（ iii ）鑒定 m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶或去甲基酶的生理作用靶點(diǎn)。 SELECT 方法不僅簡化了生物學(xué)樣品中 m6A 修飾的檢測過程，實(shí)現(xiàn)低豐度 RNA 中 m6A 單堿基分辨率的檢測，還能夠應(yīng)用于其他 RNA 化學(xué)修飾的檢測中，例如 N1- 甲基腺嘌呤（ N1-methyladenosine ， m1A ）和 2’-O- 甲基化修飾（ 2’-O-methylation ， Nm) 等。

軸突導(dǎo)向因子受體Robo3在調(diào)控軸突導(dǎo)向過程中發(fā)揮著重要作用。Robo3有兩個(gè)選擇性剪接體，Robo3.1和Robo3.2；它們分別在連合神經(jīng)元穿越脊髓底板前和后的軸突中特異表達(dá)，從而分別控制軸突穿越底板。姬生健在美國工作期間參與的研究表明，Robo3.2可以在穿越后的軸突中局部翻譯并受無義介導(dǎo)的RNA衰減（NMD）通路的調(diào)控（Colak, Ji et al., Cell）。 姬生健課題組接著對Robo3.1在連合神經(jīng)元的穿越前軸突內(nèi)高表達(dá)而在穿越后突觸內(nèi)消失這一現(xiàn)象進(jìn)行了深入的機(jī)制研究。課題組首次發(fā)現(xiàn)Robo3.1蛋白質(zhì)的半衰期非常短，其蛋白水平的維持需要持續(xù)性的翻譯。接著，課題組發(fā)現(xiàn)Robo3.1的mRNA被m6A修飾，并可以和m6A閱讀器蛋白YTHDF1結(jié)合。小鼠的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明，Robo3.1的翻譯受YTHDF1調(diào)控，從而控制連合神經(jīng)元的軸突導(dǎo)向。

鑒定了擬南芥中的 m6A 去甲基酶 ALKBH10B ，發(fā)現(xiàn) ALKBH10B 缺失會導(dǎo)致擬南芥顯著的晚花表型， ALKBH10B 通過影響 FT ， SPL3 和 SPL9 的甲基化水平調(diào)控?cái)M南芥的成花誘導(dǎo)。不同的識別蛋白通過對 m6A 的結(jié)合，對 mRNA 的加工代謝產(chǎn)生不同的調(diào)控作用， 進(jìn)而 影響細(xì)胞不同的生理功能。通過開發(fā)甲醛交聯(lián)- 免疫共沉淀(Formaldehyde-crosslinking and immunoprecipitation, FA-CLIP) 技術(shù)，鑒定出全轉(zhuǎn)錄組水平的ECT2-mRNA 相互作用位點(diǎn)，揭示ECT2 主要結(jié)合mRNA 的 3' 非翻譯區(qū)(3'UTR), 并且傾向于結(jié)合保守序列 URUAY (R=G>A, Y=U>A,  其中 UGUAY 序列 占 90% 以上 ) 。使用植物細(xì)胞核裂解液進(jìn)行的體外酶活實(shí)驗(yàn)和凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（ EMSA ）證明 UGUA 序列為 植物特有的m6A 保守序列，且UGUm6A 可以被ECT2 高特異性識別。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明ECT2 蛋白分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，結(jié)合高通量測序數(shù)據(jù)分析，推測ECT2 具有雙重功能，ECT2 可能在細(xì)胞核中通過結(jié)合甲基化的UGUA 調(diào)控pre-mRNA 的 3'UTR 加工，在細(xì)胞質(zhì)中ECT2 促進(jìn)mRNA 的穩(wěn)定性。進(jìn)一步機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)影響表皮毛發(fā)育的三個(gè)基因ITB1, TTG1 及DIS2 的轉(zhuǎn)錄本可以被m6A 修飾且被ECT2 結(jié)合，在 ECT2 的T-DNA 插入突變體中，ITB1, TTG1 及DIS2 的mRNA 穩(wěn)定性降低，mRNA 表達(dá)量水平降低，繼而導(dǎo)致 ect2 突變體中表皮毛分叉數(shù)增多。

發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)化（EMT）過程中mRNA的m6A顯著上調(diào)，其可通過促進(jìn)EMT關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Snail的翻譯從而促進(jìn)腫瘤EMT及侵襲轉(zhuǎn)移。在腫瘤細(xì)胞EMT過程中，mRNA的m6A修飾增加。甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的缺失使得m6A水平下調(diào)，并抑制癌細(xì)胞在體外和體內(nèi)的遷移、侵襲和EMT過程。m6A-seq和功能實(shí)驗(yàn)表明，EMT的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)受m6A調(diào)控，且過表達(dá)Snail能逆轉(zhuǎn)METTL3缺失導(dǎo)致的細(xì)胞EMT抑制。進(jìn)一步研究表明，Snail mRNA的CDS區(qū)而非3’UTR區(qū)的m6A修飾，可促進(jìn)其mRNA的翻譯延伸，其可能機(jī)制是通過YTHDF1與eEF-2的共結(jié)合促進(jìn)多聚核糖體對其的翻譯作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明METTL3敲除細(xì)胞株轉(zhuǎn)移能力較野生型顯著下調(diào)，過表達(dá)Snail則可在一定程度上逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象。臨床分析表明肝癌組織中Mettl3和YTHDF1表達(dá)高于癌旁組織，其上調(diào)是肝癌患者總體生存率（OS）不良預(yù)后因素。

m6A修飾參與腫瘤細(xì)胞的糖酵解和ATP生成。甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的缺失使得m6A水平下調(diào)，并抑制腫瘤細(xì)胞的葡萄糖攝入、乳酸產(chǎn)生速率和ATP生成。m6A-seq和功能實(shí)驗(yàn)表明，PDK4的表達(dá)受m6A調(diào)控，且過表達(dá)PDK4能逆轉(zhuǎn)METTL3缺失導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞糖酵解和ATP生成抑制。進(jìn)一步研究表明，PDK4 mRNA的5’UTR區(qū)而非3’UTR區(qū)的m6A修飾，可通過與YTHDF1/eEF-2復(fù)合物和IGF2BP3結(jié)合，從而正向調(diào)節(jié)其mRNA的翻譯延伸及mRNA穩(wěn)定性。此外，TATA結(jié)合蛋白（TBP）可以通過與METTL3啟動子結(jié)合增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄及在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)。體內(nèi)和臨床分析表明，m6A/PDK4在宮頸癌和肝癌組織表達(dá)上調(diào)，且對其發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用。?本研究利用dCas13b融合去甲基化酶ALKBH5，結(jié)合靶向mRNA的gRNA，構(gòu)建出可在活細(xì)胞內(nèi)靶向mRNA的m6A去甲基化修飾體系dm6ACRISPR。該體系具有特異性強(qiáng)、去甲基化效率高和脫靶率低等特點(diǎn)。研究表明，dm6ACRISPR可實(shí)現(xiàn)CYB5A mRNA的單位點(diǎn)及CTNNB1 mRNA的多位點(diǎn)去甲基化，提高靶mRNA穩(wěn)定性。同時(shí)，dm6ACRISPR具有高度錯(cuò)配不耐受的特點(diǎn)，其細(xì)胞內(nèi)脫靶率僅為0.03%。此外，在腫瘤細(xì)胞中運(yùn)用dm6ACRISPR體系靶向促癌基因EGFR和MYC，可顯著降低其表達(dá)水平，同時(shí)明顯抑制腫瘤細(xì)胞生長，表明dm6ACRISPR在疾病防治上具有潛在價(jià)值。

隨著首個(gè)RNA修飾N6-甲基腺嘌呤（m6A）的去修飾酶FTO的發(fā)現(xiàn)，RNA表觀遺傳學(xué)/表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)開始興起并成為表觀遺傳學(xué)新的研究熱點(diǎn)。m6A作為首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的可逆RNA修飾，廣泛存在于mRNA，依賴修飾酶、去修飾酶和結(jié)合蛋白發(fā)揮調(diào)控功能。已發(fā)現(xiàn)m6A具有調(diào)控mRNA剪接、出核、穩(wěn)定性和蛋白翻譯等功能，可以參與發(fā)育、配子發(fā)生、細(xì)胞重編程、生物節(jié)律、疾病等多種生理和病理過程的功能調(diào)控。為了更好地研究m6A生物功能和臨床病理研究，開發(fā)m6A高通量測序技術(shù)一直是研究的熱點(diǎn)。 現(xiàn)有m6A測序技術(shù)主要依賴于m6A抗體富集技術(shù)，包括低分辨率的m6A-seq/MeRIP-seq和聯(lián)用iCLIP或PAR-CLIP技術(shù)的高分辨率m6A測序技術(shù)miCLIP 或PA-m6A-seq。抗體存在對特定RNA序列或結(jié)構(gòu)的潛在非特異性結(jié)合，為了解決抗體方法的種種問題，研究者們做出了各種嘗試，近期開發(fā)了兩類無需抗體的m6A測序技術(shù)，一類為利用對特定甲基化序列（m6ACA）敏感的RNA核酸內(nèi)切酶MazF輔助的測序方法（m6A-REF-seq or MAZTER-seq），此類方法只能檢測16~25%的m6A位點(diǎn)；另一種是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)融合m6A-binding domain（YTH）與胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1）的融合蛋白實(shí)現(xiàn)的m6A測序（DART-seq），但該方法依賴于細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率且受限于體外樣品的使用。 賈桂芳課題組一直致力于開發(fā)和利用核酸化學(xué)生物學(xué)技術(shù)研究RNA化學(xué)修飾在動植物中的生物功能研究。在本課題中，賈桂芳課題組巧妙地利用m6A的去甲基酶FTO蛋白作為催化劑，將mRNA上化學(xué)惰性的m6A轉(zhuǎn)化為高反應(yīng)活性的中間態(tài)產(chǎn)物N6-羥甲基腺嘌呤（hm6A），然后利用二硫蘇糖醇（DTT）的巰基與hm6A發(fā)生亞胺1,2加成反應(yīng)，將不穩(wěn)定的hm6A轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的巰基加成產(chǎn)物dm6A。dm6A上的自由巰基可以與甲烷硫代磺酸（methanethiosulfonate，MTSEA）快速反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)在mRNA上m6A的位置標(biāo)記生物素Biotin，最終可被鏈霉親和素珠捕獲，從而富集含有m6A修飾的RNA片段供后續(xù)高通量測序使用。

   FTO對人體發(fā)育至關(guān)重要，F(xiàn)TO酶活功能的紊亂會影響發(fā)育和多種疾病的發(fā)生，包括肥胖和癌癥等。N6-甲基腺嘌呤（m6A）作為mRNA上含量最為豐富的甲基化修飾，是首個(gè)被報(bào)道的FTO去甲基酶活生理底物。之后陸續(xù)報(bào)道FTO生理底物還包括mRNA上5’帽端后的N6，2'-O-二甲基化腺嘌呤（cap m6Am），snRNA的m6A和m6Am，tRNA的N1-甲基腺嘌呤（m1A），除此之外還有體外活性底物單鏈DNA上的N6-甲基脫氧腺嘌呤（6mA）和N3-甲基胸腺嘧啶（3mT）與單鏈RNA上的N3-甲基尿嘧啶（m3U）。FTO如何識別眾多的核酸修飾堿基，是否有催化選擇性，如何結(jié)合多種RNA，F(xiàn)TO為什么對cap m6Am的活性高于單鏈RNA上的m6A，及FTO為什么對單鏈RNA或DNA上的m1A沒有活性卻對tRNA或莖環(huán)結(jié)構(gòu)上的m1A有活性？回答這些FTO的酶催化分子機(jī)制有待于蛋白-核酸復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的解析。然而FTO蛋白與核酸底物結(jié)合力太弱，致使獲得FTO蛋白-核酸復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)一直是該領(lǐng)域的挑戰(zhàn)和難點(diǎn)。

 M6是一款3D可自由移動的室內(nèi)掃描系統(tǒng)，能夠在環(huán)境中進(jìn)行快速掃描來捕獲室內(nèi)可視化的所有數(shù)據(jù)，并可以實(shí)現(xiàn)無間斷作業(yè)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)高采集效率與數(shù)據(jù)質(zhì)量。

產(chǎn)品詳細(xì)介紹性能特點(diǎn)：1、微機(jī)控制，觸摸面板，數(shù)字顯示。2、采用交流變頻電機(jī)，進(jìn)口環(huán)保壓縮機(jī)，進(jìn)口高速軸承。3、自動計(jì)算RCF值。4、可直接設(shè)定RCF或轉(zhuǎn)速，可進(jìn)行梯度分離。5、具有超溫、超速、不平衡、門蓋安全保護(hù)功能。6、制冷、加熱雙回路控溫。技術(shù)參數(shù)：型號名稱： DL-6M/DL-6MI 冷凍大容量離心機(jī)顯示方式： LED/LCD最高轉(zhuǎn)速： 6000rpm旋轉(zhuǎn)精度： ±30rpm最大相對離心力： 6680×g最大容量： 6×1000mL控溫范圍： －20～40℃控溫精度： ±1℃定時(shí)范圍： 0～23h59min電機(jī)： 交流變頻門鎖： 機(jī)械門鎖噪音： ≤65dB（A）電源： AC220V，50Hz，30A外形尺寸： 840×730×1240mm重量： 260kg轉(zhuǎn)子：NO.1角轉(zhuǎn)子： 6000rpm，6680×g，6×500mLNO.2水平轉(zhuǎn)子： 4200rpm，5100×g，6×1000mL關(guān)鍵詞：冷凍大容量離心機(jī)

發(fā)現(xiàn)在軸突中特異性抑制FTO或敲低FTO均顯著地降低了GAP-43 mRNA 的局部翻譯。進(jìn)一步的抗m 6 A免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)FTO通過調(diào)節(jié)GAP-43 mRNA的m 6 A水平從而影響GAP-43的局部翻譯。在過表達(dá)野生型GAP-43的神經(jīng)元中，抑制FTO可以顯著地降低GAP-43的局部翻譯水平，同時(shí)顯著地抑制了軸突的生長。而在過表達(dá)m 6 A 位點(diǎn)突變的GAP-43的神經(jīng)元中，抑制FTO對GAP-43的蛋白水平及軸突的生長均沒有影響。因此，該研究證實(shí)FTO可以通過調(diào)控軸突中GAP-43 mRNA的m 6 A水平從而影響其局部翻譯，進(jìn)而調(diào)節(jié)軸突的生長。