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項(xiàng)目成果/簡(jiǎn)介:本發(fā)明提供茶樹(shù)咖啡堿合成酶基因啟動(dòng)子TCSP及其在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用.本發(fā)明以茶樹(shù)DNA為模板,用GenomeWalking方法克隆得到茶樹(shù)TCS基因啟動(dòng)子序列,然后利用Gateway技術(shù)構(gòu)建重組植物表達(dá)載體pKGWFS7TCSP,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化,以表達(dá)GUS基因的方式進(jìn)行啟動(dòng)子活性功能驗(yàn)證.本發(fā)明首次從茶樹(shù)中克隆出特異性咖啡堿合成酶基因啟動(dòng)子TCSP,并驗(yàn)證了其活性,對(duì)于揭示茶樹(shù)咖啡堿合成的機(jī)理,生物調(diào)控茶樹(shù)咖啡堿的含量具有重要意義.

本發(fā)明提供茶樹(shù)咖啡堿合成酶基因啟動(dòng)子TCSP及其在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用.本發(fā)明以茶樹(shù)DNA為模板,用GenomeWalking方法克隆得到茶樹(shù)TCS基因啟動(dòng)子序列,然后利用Gateway技術(shù)構(gòu)建重組植物表達(dá)載體pKGWFS7TCSP,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化,以表達(dá)GUS基因的方式進(jìn)行啟動(dòng)子活性功能驗(yàn)證.本發(fā)明首次從茶樹(shù)中克隆出特異性咖啡堿合成酶基因啟動(dòng)子TCSP,并驗(yàn)證了其活性,對(duì)于揭示茶樹(shù)咖啡堿合成的機(jī)理,生物調(diào)控茶樹(shù)咖啡堿的含量具有重要意義.

分析報(bào)道了人類AARS家族成員之一，Tyrosyl-tRNA合成酶 (TyrRS)中的兩個(gè)新型剪接異構(gòu)體。這兩個(gè)剪接異構(gòu)體分別去除了第2-4個(gè)和第2-3個(gè)外顯子，導(dǎo)致其蛋白產(chǎn)物喪失了原始TyrRS中的催化核心和二聚體相互作用界面部分。但是，隨后的生化分析表明，這兩個(gè)剪接異構(gòu)體仍能夠形成兩個(gè)具有不同構(gòu)象的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，其中一個(gè)剪接異構(gòu)體由于剪接位點(diǎn)而形成了一個(gè)全新的Coiled-coil區(qū)域，用來(lái)形成一個(gè)新的二聚體相互作用界面；與此相反，另一個(gè)剪接異構(gòu)體，由于其剪接位點(diǎn)導(dǎo)致的抑制效果，從而趨向形成單體。與大多數(shù)TyrRS在各組織細(xì)胞中均勻分布不同，這兩種新的剪接異構(gòu)體顯示出明顯的組織偏好性，其中分別在淋巴細(xì)胞中和肺中富集表達(dá)，表明它們可能由于聚合狀態(tài)的差異而具有不同的生物學(xué)特性。      該研究結(jié)果闡釋了人類TyrRS具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)可塑性，在不同組織中具有不同的結(jié)構(gòu)重組功能，這為今后研究AARS剪接異構(gòu)體全新的生物學(xué)功能和潛在的疾病醫(yī)療效用提供了重要的參考價(jià)值。目前，aTyr制藥（美國(guó)NASDAQ上市公司）正在利用相關(guān)研究成果進(jìn)行轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究，開(kāi)發(fā)新型藥物。

本發(fā)明公開(kāi)了一種蔗糖合成酶在調(diào)控植物果實(shí)發(fā)育中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將蔗糖合成酶的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物果實(shí)產(chǎn)量大于所述目的植物。所述蔗糖合成酶的編碼基因具體可為蔗糖合成酶基因CsSus4。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了蔗糖合成酶基因CsSus4在黃瓜果實(shí)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著的關(guān)鍵性作用，可以調(diào)節(jié)庫(kù)強(qiáng)從而促進(jìn)果實(shí)的

西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李小波團(tuán)隊(duì)在The Plant Cell在線發(fā)表了題為An unexpected hydratase synthesizes the green light-absorbing pigment fucoxanthin的最新研究論文，報(bào)道了"海洋雜色藻巖藻黃素(Fucoxanthin)生物合成途徑中末端酶，其催化了巖藻黃素中特征的酮基(keto)的產(chǎn)生"。

本發(fā)明公開(kāi)一種核苷酸合成酶 CAD 在治療動(dòng)脈粥樣硬化中的功能和應(yīng)用，屬于基因的功能與應(yīng)用 領(lǐng)域。本發(fā)明以 ApoE-/-小鼠及 CAD-/-ApoE-/-小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)獲得動(dòng)脈粥樣硬化模型， 結(jié)果表明與

成果簡(jiǎn)介： 本研究提供了一種基于ATP再生系統(tǒng)和雙功能谷胱甘肽合成酶（GshF）的酶法制備谷胱甘肽的方法。在谷胱甘肽合成過(guò)程中，經(jīng)典的酶法是由谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶兩步催化完成的。而 GshF可一步催化谷胱甘肽合成，簡(jiǎn)化的反應(yīng)步驟，且該酶反饋抑制作用小，非常適合應(yīng)用于酶法合成谷胱甘肽。酶法合成谷胱甘肽需要大量消耗ATP，通過(guò)引入高

CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated proteins)是目前最常用的基因編輯工具酶，在科研領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，而在臨床方面的應(yīng)用因?yàn)槠涿摪谢钚砸欢韧磺?。它通過(guò)guide RNA（gRNA）與靶向DNA序列的配對(duì)，從而將Cas9錨定在靶向基因并誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（DSB）。在基因編輯誘發(fā)的DSB的修復(fù)過(guò)程中，一定幾率會(huì)產(chǎn)生基因突變或者外源DNA片段的插入，從而達(dá)到基因編輯的目的。在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，一個(gè)好的基因編輯酶Cas9需要同時(shí)滿足高效切割靶位點(diǎn)、低脫靶活性和低染色體異常三個(gè)特點(diǎn)。目前在這三個(gè)方面，有一部分基于PCR的方法用于估算基因編輯效率，但其結(jié)果可靠性有待提高；有一些基于高通量測(cè)序的方法可以在體內(nèi)或者體外檢測(cè)基因編輯酶的脫靶活性；尚無(wú)系統(tǒng)的可定量的測(cè)量基因組異常結(jié)構(gòu)的方法。本項(xiàng)目開(kāi)發(fā)了一種新的方法，可以用來(lái)同時(shí)定量檢測(cè)Cas9編輯效率和脫靶活性以及編輯引起的染色體異常結(jié)構(gòu)，即primer-extension-mediated sequencing（PEM-seq）。這是對(duì)基因編輯和DNA損傷修復(fù)等領(lǐng)域都有巨大促進(jìn)作用的新技術(shù)。與此同時(shí)，該項(xiàng)目包括了該團(tuán)隊(duì)利用PEM-seq篩選出的一個(gè)相比于現(xiàn)有Cas9變體具有更低脫靶活性且與野生型Cas9切割效率相當(dāng)?shù)腃as9變體further enhanced Cas9 (FeCas9)。

左旋肉堿，又稱L-肉堿，是一種促使脂肪轉(zhuǎn)化為能量的類氨基酸，目前主要作為減肥藥被 使用，也被應(yīng)用于保健和食品等領(lǐng)域，已被美國(guó)、瑞士、法國(guó)、中國(guó)和世界衛(wèi)生組織定為法定 的多用途營(yíng)養(yǎng)劑。目前全球年需求量上千噸，據(jù)我國(guó)海關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013年8月左旋肉堿及其 衍生物出口數(shù)量為2777千克，出口金額為120萬(wàn)美元，出口單價(jià)為450美元/千克，2013年1-8月 總出口量為 25,762千克，出口金額為850萬(wàn)美元。 本項(xiàng)目開(kāi)發(fā)了一種酶促不對(duì)稱還原4-氯乙酰乙酸乙酯制備左旋肉堿藥物關(guān)鍵手性中間體 (R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的技術(shù)。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：該合成路線反應(yīng)條件溫和(30℃，pH 6.5)、合 成路線短、能耗低，從技術(shù)上具有很好的應(yīng)用前景。此外，底物濃度為100 g/L以上，產(chǎn)品收 率高(85%以上)，產(chǎn)品光學(xué)純度好(99%以上)。因此，產(chǎn)品品質(zhì)高，具有很好的市場(chǎng)前景。 

成果描述：利用水解酶催化的高效、高選擇性以及反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，在酶促合成藥物、天然產(chǎn)物以及新型高分子藥物方面進(jìn)行了重要的發(fā)展，所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)生物催化的應(yīng)用和理論研究均有重要意義。主要包括脂肪酶高選擇性催化合成一系列可聚合莽草酸乙烯酯衍生物，具有藥理活性的、水溶性得到提高的酮洛芬糖脂衍生物，一系列烷基取代的苯并咪唑衍生物以及酮洛芬的聚酯前藥等。反應(yīng)選擇性好，產(chǎn)率高，同時(shí)所得到的高分子前藥具有較好的緩釋效果，部分化合物還表現(xiàn)出熱敏性，為其進(jìn)一步的應(yīng)用提供更多的基礎(chǔ)。市場(chǎng)前景分析：還處于實(shí)驗(yàn)室研制階段。與同類成果相比的優(yōu)勢(shì)分析：反應(yīng)活性及選擇性的控制 大規(guī)模反應(yīng)條件的控制 國(guó)際先進(jìn)