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通過基因工程手段，構建了高產 L-天冬氨酸酶和 L-天冬氨酸-α-脫羧酶共表達重組菌株。主要技術指標： 在轉化體系中，濕菌體添加量 20 g/L，底物 富馬酸 158.0 g/L，轉化周期 12~14 h，β-丙氨酸產量 118.6 g/L，底物摩爾轉化率 98%；(2) 濕菌體添加量 30 g/L，底物富馬酸 216.0 g/L，轉化 12~14 h，β-丙氨酸產量 162.1 g/L，底物摩爾轉化率 98%。 關鍵技術 以大腸桿菌為宿主，生長快，周期短，催化效率高；(2)以廉價的富馬酸為底物生產高附加值β-丙氨酸，成本低，收益高；(3)微生物轉化具有專一性強、條件溫和的優點，該法綠色、環保、可持續，具有經濟競爭力，有很好的產業應用前景。 

L-纈氨酸是生命有機體的重要組成部分，在生命體內物質代謝調控和信息傳遞等許多方面扮演著重要角色。L-纈氨酸屬于八種必需氨基酸之一，也是三種支鏈氨基酸之一。L-纈氨酸發酵是典型的代謝控制發酵。國內雖有天然蛋白質水解液分離提取 L-纈氨酸的產品，但由于其產量很低，質量不佳，純度不高，所以無法實現大規模工業化生產。利用微生物發酵法生產 L-纈氨酸具有原料成本低，反應條件溫和及易實現大規模生產等優點，是一種非常經濟的生產方法。但是， 以微生物發酵法生產 L-纈氨酸，國內大多數菌株的產酸水平不高，特別是 L-纈氨酸的生產水平和產量遠不能滿足國內市場的需求。因此，開展發酵法生產 L-纈氨酸的研究具有極其重要的意義。本研究室通過高通量篩選策略，獲得一株高產纈氨酸的黃色短桿菌。 

C8H9NO3；左旋-α-對羥基苯基氨基乙酸是β-內酰胺類半合成抗生素的側鏈重要原料，是新型廣譜抗生素阿莫西林（Amoxicillin），阿撲西林（Aspoxicillin）、頭孢哌酮（Cefoperazone），頭孢羥氨芐（Cefodroxil）、頭孢羅齊（Cefoprozil）等藥物的必不可少的重要中間體，其在醫藥工業上應用廣泛，發展前途廣闊。同時，它還應用于感光領域和用作鐵、磷、硅等的分析試劑。   開發的本課題已經過湖北省化工行業辦鑒定，技術處于國內領先水平。本課題已作為湖北省科技攻關項目。

在泡騰飲料、泡騰藥物和膨松食品中，一甘氨酸鈉碳酸鹽（mono-SGC）是較理想的二氧化碳氣體的來源。與其它用作發泡劑的無機化合物（比如碳酸氫鈉）相比較，一甘氨酸鈉碳酸鹽有更優越的理化性質和應用范圍。一甘氨酸鈉碳酸鹽分解后的產物是甘氨酸和二氧化碳。甘氨酸是人體必須的氨基酸，可用來治療胃酸過多與肌力衰竭，在膠原中的含量為25%-30%。所以一甘氨酸鈉碳酸鹽用作藥物和食品中的發泡劑較為安全。一甘氨酸鈉碳酸鹽在國外已應用于食品和醫藥工業中，一項美國專利報道了一甘氨酸鈉碳酸鹽的制備，但產率只有77%。用我們改進的方法合成一甘氨酸鈉碳酸鹽產率可達90%。

谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)被廣泛用于食品工業生產，是一種安全性很高的工業菌株；具有包括 Sec 和 Tat 分泌途徑在內完善的蛋白分泌系統；沒有類似于大腸桿菌(E. coli)所帶來的內毒素和宿主細胞蛋白污染等問題。這些顯著優點使它成為一種有吸引力的外源蛋白表達生產用的底盤細胞。目前國內生物醫藥領域主要依賴于 E.coli 表達體系生產醫藥蛋白，原創性外源蛋白表達體系的缺失，在知識產權方面將制約到我國生物醫藥產業的發展。該項成果有望為我國生物醫藥產業提供一個具有自主知識 產權的谷氨酸棒桿菌安全高效外源蛋白表達體系。

以加壓溶劑提取法為基礎，并以高效液相色譜為檢測手段，考察了無水乙醇作溶劑時，壓力、加壓時間對蒜氨酸提取量的影響。并經過離子交換樹脂柱以及重結晶提純得到蒜氨酸純品。該法無需經過滅酶，避免了高溫或者低溫的工作環境，在室溫下就可以完成蒜氨酸的提取。對比國外普遍采用的超低溫真空破碎分離提取、冷凍干燥等工藝，設備投資小，工藝過程簡單，便于人員操作，對生產人員知識和技術要求不高，易于實現工業化生產。 

項目研究背景： 該工藝以廉價的 L-Cbz-蛋氨酸為原料， 經內酯化反應 得到關鍵的中間體 N-Cbz-L- 高絲氨酸內酯， 再與丙基溴反應對羧基進行保 護得到羥基丁酸丙酯衍生物，然后 PBr3 作為鹵化試劑發生鹵化反應，引 入溴離子離去基，含有離去基的側鏈與 N-羥基鄰苯二甲酰亞胺發生 N-烷 化反應，引入 NH2-O 健，接著在濃鹽酸中脫去保護基并發生水解酞酰亞 胺反應，得到含有

琥珀酸是直鏈飽和二元羧酸，為重要的化工原料，可以合成1，4-丁二酯、四氫呋喃、γ-丁內酯、己二酸等，廣泛應用于醫藥、農藥、染料、香料、油漆、食品、塑料和照相材料工業。近年來，由于不斷開拓新的應用領域，琥珀酸的需求猛增。利用微生物發酵生產琥珀酸是以可再生資源取代石油生產的一種綠色平臺化學技術。同時，發酵法生產琥珀酸過程中需要CO2，將發酵生產琥珀酸與CO2的生物固定過程進行偶合，更有可能將乙醇發酵過程中的CO2或者其他行業的含CO2廢氣加以利用，開辟了溫室氣體利用的新途徑，從長遠利益來講有利于減緩全球變暖和能源危機。本項目利用代謝工程大腸桿菌進行琥珀酸發酵，通過發酵過程的相關調控，顯著提高琥珀酸的合成和對葡萄糖的得率。同時設計了特殊的反應器，提高了二氧化碳的固定效率，實現了有效的琥珀酸生產和二氧化碳固定。主要參數如下：琥珀酸濃度：59g/L；葡萄糖轉化率：1.24mol/mol；生產強度：1 g/L/h；本項目的主要創新和技術優勢在于：1）利用廉價培養基實現琥珀酸的高效生產，過程簡單，產量和生產強度較高，葡萄糖轉化效率高；2）固定CO2效果良好，可與乙醇發酵或其它釋放CO2的工藝有效偶聯，減少CO2排放，并進一步降低成本；3）副產物少，提取方便。

通過微生物育種和基因工程手段相結合，獲得了一株脯氨酸高產菌株黃色短桿菌。發酵培養 65~68 h， L-脯氨酸產量高達 100 g/L，葡萄糖得率為 45%左右。 關鍵技術 (1)本研究以玉米漿為氮源，有效的降低了發酵成本； (2)以葡萄糖和味精為原料生產 L-脯氨酸的高轉化率發酵，該法綠色、環保、可持續，具有經濟競爭力，有很好的產業應用前景。

γ-聚谷氨酸（Poly-γ-glutamic acid）是一種重要的天然聚合物，由 于其具有良好的性質已被廣泛應用于食品，化妝品，醫藥，材料等領 域。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）LL3 是一株谷氨酸 非依賴型 γ-PGA 合成菌。為了提高其 γ-PGA 產量，項目組采用無痕 基因編輯技術對菌株進行了代謝工程改造。包括三部分：模塊化代謝 通路改造；蔗糖代謝途徑改造；谷氨酸合成途徑改造。 B. amyloliquefaciens LL3 是項目組從發酵食品中分離得到，它能 夠從蔗糖出發合成 γ-PGA。利用模塊化通路改造策略對 γ-PGA 合成 相關的八個代謝通路進行改造包括：γ-PGA 降解相關途徑；細胞呼吸 鏈；胞外蛋白及胞外蛋白酶合成途徑；細菌多糖合成途徑；次級小分 子代謝產物合成途徑；細胞自誘導因子合成途徑；谷氨酸合成途徑以 及 γ-PGA 合成途徑。最終整合獲得的最優基因工程菌株 NK-anti-rocG （敲除了 epsA-O 操縱子（負責胞外多糖合成），sac 操縱子（負責果 聚糖合成），lps（脂多糖合成相關），pta（乙酸合成相關），pgdS（γ-PGA 降解酶），cwlO（細胞壁水解酶），luxS（AI-2 合成）以及表達 anti-rocG sRNA（抑制谷氨酸脫氫酶表達））γ-PGA 搖瓶發酵產量從 3.8 g/L 提高到 11.04 g/L，較對照菌株提高了 2.91 倍。γ-PGA 產物純度也 從 78.6%提高到 95.2%。5-L 罐補料分批發酵實驗得到 NK-anti-rocG 菌株產量可達 20.3 g/L。分子量 450,000 Dal，純度 95%以上。 項目特色： 1. 菌種（Bacillus amyloliquefaciens）LL3 是谷氨酸非依賴型 γ-聚谷 氨酸合成菌株；發酵生產主要原料為蔗糖； 2. 補料分批發酵產量為：20.3 g/L。 3. 授權專利號為：ZL200810053900.7 市場應用前景： γ-聚谷氨酸（Poly-γ-glutamic acid）是一種重要的天然聚合物，由 于其具有良好的性質已被廣泛應用于食品，化妝品，醫藥，材料等領 域。本項目采用谷氨酸非依賴型 γ-聚谷氨酸合成菌做為發酵菌種，以 蔗糖為原料發酵法生產 γ-聚谷氨酸，可產生巨大的經濟效益和社會效 益。