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本發(fā)明涉及一種黃粉蟲肽的分離鑒定及功能分析方法，采用超聲處理、技術(shù)篩選、超濾分子截流、分子篩、反相高壓液相色譜(HPLC)柱層析、質(zhì)譜和氨基酸分析等技術(shù)，從誘導(dǎo)的黃粉蟲中分離到氨基酸序列為SEQ?ID?NO : 1的八肽，并進一步驗證其抗氧化活性，證實其抗氧化功能強于谷胱甘肽，為該天然抗氧化八肽的產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

本項目的特點是尿綜合利用聯(lián)產(chǎn)工藝，可將尿激酶、激肽釋放酶，抑肽酶和高純度尿多酸肽四種成分分別提取分離出來，能大大降低成本。高純度高分子尿激酶新工藝曾與中國藥品檢定所共同舉辦了學(xué)習(xí)班，轉(zhuǎn)讓給了四家藥廠還承擔制作了國家標準品和亞太地區(qū)國際標準品，MW54，000達100%，而英國制作的樣品只有60%。尿多酸肽是國際上唯一的尿制劑抗癌藥物，但含75%尿素、銨鹽、類黑精、雜醇油等大量雜質(zhì)，副作用大，穩(wěn)定性差。本工藝排雜徹底，提取分離純化手段先進，成本低，收率高，純度高，活性高，無副作用。

泛素-蛋白酶體體系（Ubiquitin-Proteasome System，簡稱UPS）是細胞內(nèi)最重要的蛋白質(zhì)降解通路，對維持生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的濃度平衡，以及對調(diào)控蛋白、錯誤折疊或受到損傷的蛋白的快速降解起著至關(guān)重要的作用，參與了細胞周期、基因表達調(diào)控等多種細胞進程，由UPS失常引發(fā)的蛋白質(zhì)新陳代謝異常與眾多人類重大疾病直接相關(guān)。2004年，Aaron Ciechanover, Irwin Rose和Avram Hershko三位科學(xué)家被授予了諾貝爾化學(xué)獎，以表彰他們對該降解通路的發(fā)現(xiàn)。UPS中蛋白酶體是細胞中最基本的、最重要的不可或缺的、最為復(fù)雜的大型全酶超分子復(fù)合機器之一，人源蛋白酶體全酶包含至少33種不同的亞基，總原子質(zhì)量約為2.5MDa。美國FDA批準的多種治療癌癥的藥物分子即以蛋白酶體為直接靶標。近年來，隨著冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，人們對這一大分子機器的結(jié)構(gòu)和功能研究得以不斷深入。2016年，毛有東課題組與合作者報道了人源蛋白酶體基態(tài)的3.6?冷凍電鏡結(jié)構(gòu)及其他三個亞納米分辨構(gòu)象，并首次發(fā)現(xiàn)一個亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象的核心顆粒（Core Particle，簡稱CP）底物轉(zhuǎn)運通道處于開放狀態(tài)（見PNAS 2016, 113: 12991-12996）。2018年4月，該課題組又報道了6個ATPγS結(jié)合狀態(tài)下的26S動態(tài)結(jié)構(gòu)，包括三個CP開放態(tài)對應(yīng)的亞穩(wěn)簡并態(tài)近原子分辨（4~5?）結(jié)構(gòu)（見Nature Communications 2018, 9: 1360）。盡管這些工作揭示了蛋白酶體的基本架構(gòu)和內(nèi)在運動行為，但由于缺乏蛋白酶體與底物之間的相互作用，人們對于蛋白酶體如何實現(xiàn)底物降解的原子水平工作機制仍一無所知。此外，盡管冷凍電鏡技術(shù)近年來廣泛應(yīng)用于分析具有動態(tài)特征的蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)和平衡態(tài)構(gòu)象，但對其中間態(tài)結(jié)構(gòu)和非平衡構(gòu)象分析的分辨率水平往往局限在4～6埃或更低，離真正的全原子水平動力學(xué)分析還有相當一段距離。 為了真正實現(xiàn)原子水平的蛋白酶體底物降解動態(tài)過程的冷凍電鏡三維重建和動力學(xué)表征，毛有東課題組攻克了兩大技術(shù)難題。其一，如何在蛋白酶體完成底物降解之前抓到它的所有可能的中間態(tài)構(gòu)象？課題組發(fā)展了一種新穎的核酸置換法，利用ATPγS降低AAA-ATPase激酶水解活性的特點，在底物降解中間過程，通過將ATP快速置換成ATPγS，結(jié)合快速冷凍的優(yōu)勢，從而撲捉到蛋白酶體在底物降解過程的中間態(tài)。其二，如何在從冷凍電鏡數(shù)據(jù)中分析出更多構(gòu)象的同時，還把分辨率做到3埃甚至更好？課題組通過多年持續(xù)努力，發(fā)展了多種基于人工智能和機器學(xué)習(xí)的冷凍電鏡圖像聚類的新型算法，并針對蛋白酶體的動力學(xué)特征，設(shè)計了一套極其有效的整合了多種算法的多構(gòu)象分類流程。通過這兩套技術(shù)方案的完美結(jié)合，課題組成功解析了人源蛋白酶體在降解底物過程中的七種不同的、但差別甚微的、高分辨原子水平的天然態(tài)構(gòu)象（Native states），完整展示了蛋白酶體從泛素結(jié)合到去泛素化，再到底物轉(zhuǎn)運的動態(tài)過程。與同期在Science上發(fā)表的與底物結(jié)合的酵母蛋白酶體的4.2-4.7埃冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（Science doi: 10.1126/science.aav0725，來自加州伯克利分校和Scripps研究所）相比，該Nature論文不僅總構(gòu)象數(shù)量多一倍，全部構(gòu)象分辨率還高1-2埃。由于Science論文采用了抑制Rpn11去泛素活性的策略，其非天然態(tài)結(jié)構(gòu)中底物并不能真正自由轉(zhuǎn)運，所推測的機理僅限于底物轉(zhuǎn)運這一步，對于其他三大Nature論文所回答重要問題均無法給出答案。這體現(xiàn)了該Nature論文不僅在實驗方法的原創(chuàng)性上和數(shù)據(jù)分析水平和質(zhì)量上，更在科學(xué)發(fā)現(xiàn)和問題探究的深度和廣度上大幅超越了來自Science的競爭性論文。圖一 七個利用冷凍電鏡解析的精細原子結(jié)構(gòu)完整揭示了從泛素識別、去泛素化反應(yīng)、轉(zhuǎn)運啟動和持續(xù)降解的核心功能動態(tài)過程。 作為整個蛋白酶體的動力來源與運轉(zhuǎn)核心，AAA-ATPase激酶分子馬達展現(xiàn)出了三種不同的核苷酸水解協(xié)作模式，6個ATPase亞基協(xié)調(diào)工作，交替與底物發(fā)生相互作用。在去泛素化過程（EB態(tài)）中，處于對立位置的兩個ATPase亞基Rpt2與Rpt4水解ATP，而Rpt5與Rpt6則釋放ADP，ATPase內(nèi)的底物轉(zhuǎn)運通道被打開，使得底物可以進入軸心通道；與此同時，去泛素化酶Rpn11亞基與泛素及底物發(fā)生相互作用，執(zhí)行其作為去泛素化酶的功能；在轉(zhuǎn)運起始過程（EC態(tài)）中，相鄰的兩個ATPase亞基Rpt1與Rpt5會同時水解ATP，調(diào)控顆粒（Regulatory Particle，簡稱RP）發(fā)生大規(guī)模轉(zhuǎn)動并釋放泛素；在底物去折疊與轉(zhuǎn)運過程（ED態(tài)）中，三個相鄰的ATPase亞基會分別同步進行ATP的結(jié)合、ADP的釋放與ATP的水解，這一過程會單向傳遞下去，將ATP水解釋放的化學(xué)能轉(zhuǎn)換為機械能，使得相應(yīng)的ATPase亞基發(fā)生剛體轉(zhuǎn)動，推動底物的去折疊和單向輸運，同時CP的轉(zhuǎn)運通道入口打開，底物被送入通道中進行降解。這些研究結(jié)果為幾十年來對蛋白酶體功能的研究提供了寶貴的第一手原子結(jié)構(gòu)和動力學(xué)信息，對于理解生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的降解過程和一系列負責物質(zhì)輸運的ATPase馬達分子的一般工作原理具有極為重要的科學(xué)意義。

本發(fā)明公開了一種抗蟲融合基因,該基因包括從5’-3’依次含有編碼BT晶體毒素Cry1的核苷酸序列和編碼Cry9Aa毒素的核苷酸序列;且上述2個核苷酸序列位于同一個開放閱讀框內(nèi)。該抗蟲融合基因包括Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Aa的修飾基因、Cry1Ab的修飾基因或Cry1Ac的修飾基因;還包括Cry9Aa或者Cry9Aa經(jīng)過修飾的基因。本發(fā)明還同時公開了上述抗蟲融合基因所編碼的融合蛋白,該融合蛋白從N端至C端依次為Cry1晶體毒素和Cry9Aa毒素。本發(fā)明的融合蛋白能用于制備轉(zhuǎn)基因抗蟲農(nóng)作物。

本發(fā)明公開了一種絲腺蠶絲蛋白的提取方法。將五齡熟蠶在水中浸死后，置于在一定溫度下放置，直至絲腺體凝固后解剖取出；將得到的中部絲腺蠶絲蛋白原料用蒸餾水清洗，除去蠶體組織雜質(zhì)，獲得中部絲腺蠶絲蛋白；將得到的后部絲腺蠶絲蛋白原料用蒸餾水清洗，得到的后部絲腺蠶絲蛋白為后部絲腺絲素；將中部絲腺蠶絲蛋白中的外層進行剝離，外層剝離得到的蠶絲蛋白為中部絲腺絲膠，剝離剩余得到的內(nèi)部蠶絲蛋白為中部絲腺絲素。本發(fā)明方法簡單有效，避免了熟蠶直接解剖時絲腺蠶絲蛋白粘性而引起的操作不易性，具有勞動強度低、提取效率高、產(chǎn)物易干燥和保存等特點；其成品可用于食品、化妝品、組織工程、載藥系統(tǒng)等多種領(lǐng)域，應(yīng)用范圍廣。

本發(fā)明涉及一種塑性絲膠蛋白膜的制備方法。目前還沒有一種工藝簡單、制備條件溫和、無有毒化交聯(lián)劑、有較好的力學(xué)性能的塑性絲膠蛋白膜的制備方法。本發(fā)明的特點在于：依次包括如下步驟：（1）將蠶絲蛋白原料置于濃度為7-11mol/L的LiBr溶液中，于30-100℃的條件下溶解處理0.25-15min，得到不溶膠狀物；（2）將步驟（1）中得到的不溶膠狀物取出，用蒸餾水洗滌數(shù)次，除去不溶膠狀物中的LiBr分子，得到絲膠蛋白膠體；（3）將步驟（2）中得到的絲膠蛋白膠攤開鋪平，干燥后制得塑性絲膠蛋白膜。本發(fā)明的工藝簡單、制備條件溫和、不添加任何化學(xué)交聯(lián)劑而獲得具有較好力學(xué)性能的塑性絲膠蛋白膜。

自1984年首個重組胰島素獲得批準以來，重組蛋白質(zhì)藥物因其高特異性及高活性逐漸受到人們的青睞；近5年來蛋白質(zhì)藥物批準的量已經(jīng)隱隱趕超傳統(tǒng)小分子藥物。然而蛋白質(zhì)藥物往往藥代動力學(xué)較差，循環(huán)時間短，需要高頻次重復(fù)用藥，給患者帶來極大的生活不便及經(jīng)濟負擔。另一個更為嚴重的問題是蛋白藥物的高免疫源性。以各類重組抗體為例，即使完全人源化的抗體在多次注射后也會產(chǎn)生大量的抗藥物抗體（anti-drug antibody，簡稱ADA）；而ADA的產(chǎn)生輕則造成藥物失去本身的藥效，重則造成嚴重的過敏反應(yīng)甚至威脅病人生命安全。因此，如何避免臨床用藥過程中（尤其是多頻次給藥過程中）ADA的產(chǎn)生成為蛋白質(zhì)藥物研發(fā)的必要前提。蛋白質(zhì)PEG化不僅能夠延長蛋白質(zhì)循環(huán)時間，也能通過其自身的位阻效應(yīng)一定程度上降低蛋白質(zhì)的免疫源性。然而PEG本身會誘發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生anti-PEG抗體（本質(zhì)上也是一種ADA），進而導(dǎo)致其加速血液清除（簡稱ABC效應(yīng)）。綜上所述，尋找新的低免疫源性聚合物用于蛋白質(zhì)修飾以同時實現(xiàn)長循環(huán)與抑制ADA產(chǎn)生迫在眉睫。 聚氨基酸（也稱合成聚多肽）是一種模擬蛋白質(zhì)多肽結(jié)構(gòu)的合成高分子，可生物降解，生物毒性低，是理想的蛋白質(zhì)藥物修飾高分子。

本技術(shù)成果首次提出將SJ16蛋白應(yīng)用于制備血吸蟲病診斷試劑，該方法不但可以區(qū)分血吸蟲的既往或 現(xiàn)行感染，且檢測靈敏度高，具有確切的早期診斷價值。

組蛋白的翻譯后修飾對于表觀遺傳調(diào)控及多種生物學(xué)過程具有重要意義。一系列新的賴氨酸化學(xué)修飾（如巴豆酰化、琥珀酰化等）展示出組蛋白修飾前所未有的多樣性及動態(tài)變化特征。可遺傳編碼的光交聯(lián)探針已經(jīng)成為研究活細胞內(nèi)蛋白-蛋白相互作用的重要工具，成功地將該技術(shù)拓展到組蛋白的化學(xué)修飾研究中，開發(fā)了可遺傳編碼的組蛋白光親和標簽，將會極大地推動組蛋白化學(xué)修飾的識別機制和功能研究。?該技術(shù)的設(shè)計包括兩個部分：a）一套帶有翻譯后修飾的賴氨酸遺傳編碼系統(tǒng)，可以在特定位點插入帶修飾的賴氨酸。此外，在賴氨酸的主鏈上還帶有光交聯(lián)基團，可在UV光下與修飾相關(guān)的蛋白發(fā)生共價交聯(lián)，可以用于研究該修飾特定的效應(yīng)蛋白。b）一套帶有保護基團的賴氨酸遺傳編碼系統(tǒng)，保護基團可以在大腸桿菌自身的還原性環(huán)境中發(fā)生脫除，將帶有光交聯(lián)基團的賴氨酸定點插入到組蛋白當中，用于證實交聯(lián)到的效應(yīng)蛋白的特異性。該團隊以巴豆酰化修飾為代表，發(fā)展了該技術(shù)對應(yīng)的賴氨酸巴豆酰化修飾的光交聯(lián)探針（K*cr）和帶有保護基團的光交聯(lián)探針（PNBK*）兩個探針，將這兩種探針分別引入到組蛋白H3的56位和79位，并通過光交聯(lián)基團捕捉到了H3上79位巴豆酰化的去乙酰化酶Sirt3。