評估基因編輯工具酶的新方法以及高保真的新基因編輯酶
CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated proteins)是目前最常用的基因編輯工具酶,在科研領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用,而在臨床方面的應(yīng)用因為其脫靶活性一度停滯不前。它通過guide RNA(gRNA)與靶向DNA序列的配對,從而將Cas9錨定在靶向基因并誘導產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(DSB)。在基因編輯誘發(fā)的DSB的修復過程中,一定幾率會產(chǎn)生基因突變或者外源DNA片段的插入,從而達到基因編輯的目的。在實際應(yīng)用過程中,一個好的基因編輯酶Cas9需要同時滿足高效切割靶位點、低脫靶活性和低染色體異常三個特點。目前在這三個方面,有一部分基于PCR的方法用于估算基因編輯效率,但其結(jié)果可靠性有待提高;有一些基于高通量測序的方法可以在體內(nèi)或者體外檢測基因編輯酶的脫靶活性;尚無系統(tǒng)的可定量的測量基因組異常結(jié)構(gòu)的方法。本項目開發(fā)了一種新的方法,可以用來同時定量檢測Cas9編輯效率和脫靶活性以及編輯引起的染色體異常結(jié)構(gòu),即primer-extension-mediated sequencing(PEM-seq)。這是對基因編輯和DNA損傷修復等領(lǐng)域都有巨大促進作用的新技術(shù)。與此同時,該項目包括了該團隊利用PEM-seq篩選出的一個相比于現(xiàn)有Cas9變體具有更低脫靶活性且與野生型Cas9切割效率相當?shù)腃as9變體further enhanced Cas9 (FeCas9)。
北京大學
2021-02-01