重組大腸桿菌生產磷脂酶D及轉酯化產品開發
磷脂酶D(PLD,EC 3.1.4.4)是一類廣泛存在于各種生物體的酶,具有水解作用和磷酰基轉移作用(見圖1)。作為一種酶制劑,PLD的轉磷脂酰活性尤為重要,被用于制備具有生物活性的稀有磷脂。其中,以大豆磷脂酰膽堿(PC)為底物,PLD酶法制備磷脂酰絲氨酸(PS),受到廣泛關注。PS作為腦健康營養補充劑,相繼被美國FDA、日本HBM和中國國家衛生計生委所認證,列為新資源食品。相較于提取自牛腦和植物的PS,生物酶法制備的PS,避免了食品安全和植物源含量低的問題。進一步,一些新的結構和功能磷脂,通過PLD轉磷脂酰反應被合成出來,例如,磷脂酰鯊肝醇、磷脂酰葡萄糖、心磷脂類似物、磷脂酰酪醇、磷脂酰萜烯和磷脂酰絲氨醇,它們中一些具有抗癌和抗氧化活性。
直到現在,受限于磷脂酶D來源不足和價格高(鏈霉菌屬PLD,≥150 units/mg,6516.9¥/1000 U,Sigma公司),其工業上的廣泛應用受到限制。例如,文獻報道的PLD最高產量在104-105U·L-1,而制備轉化得到每公斤PS,需要2.6×106U的PLD。這一障礙的主要原因是高水平表達的PLD對宿主的嚴重細胞毒性,導致細胞死亡。
歷經5年時間,從上游到下游整體設計,我們解決了毒性蛋白(磷脂酶D,PLD)異源表達難的問題(質粒不穩定、蛋白合成時間短、細胞生長抑制和裂解),PLD生產達到目前世界最高水平106U·L-1(748 mg·L-1)(提高20倍);同時發展一種簡單有效提取重組磷脂酶D的方法(無需破碎、無需添加溶菌酶和有機溶劑、室溫進行),PLD生產成本有望降低20倍以上。按照實驗室規模的一臺5 L發酵罐,年產量可以提供3.5×108U的磷脂酶D,滿足100 kg的PS轉化需求計算(不計算PLD重復利用率),擴大反應器體積至100-1000 L,PLD產量可滿足制備2-20噸PS的需求。
廈門大學
2021-01-12