多靶點(diǎn)協(xié)同抗癌候選新藥Thiotert項(xiàng)目
Thiotert(研究代號命名YLS004)是浙江大學(xué)藥學(xué)院余露山教授研究開發(fā)的抗腫瘤新藥,研究表明,其同時(shí)具有硫氧還蛋白-1(Trx-1)、端粒酶和抗代謝抗腫瘤機(jī)制等多靶點(diǎn)協(xié)同增效作用。體內(nèi)外研究結(jié)果表明,Thiotert對結(jié)直腸癌、黑色素瘤和白血病等具有顯著的療效,與多種臨床一線用藥相比在藥效和毒性方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。該新藥已獲得專利授權(quán)(ZL201811003442.6),并獲得國內(nèi)同行專家的高度評價(jià),獲得浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃專項(xiàng)(2020C03045)和中國藥學(xué)會-以嶺生物醫(yī)藥創(chuàng)新基金(2020年)的資助。目前,該候選新藥正在洽談融資擬進(jìn)行臨床前申報(bào)研究。
以下是Thiotert針對硫氧還蛋白-1和端粒酶兩個(gè)靶點(diǎn)的相關(guān)材料,其對白血病的研究還在進(jìn)行中,結(jié)果未整理到該文件。
(一)國內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢。
據(jù)2019年1月我國最新的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,2015年(統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)晚3年)我國惡性腫瘤發(fā)病約392.9萬人,死亡233.8萬人,惡性腫瘤死亡占居民全部死因的23.9%。而2018年全球范圍內(nèi)有1810萬癌癥新發(fā)病例和960萬癌癥死亡病例。由于腫瘤的高度異質(zhì)性,一些抗腫瘤藥物只能對某種或是某類腫瘤有效,而且隨著重復(fù)給藥的進(jìn)行又非常容易耐藥。同時(shí),許多腫瘤特別是耐藥性腫瘤常需要兩種或多種化療藥物聯(lián)合用藥后才能被有效抑制。這說明,這些腫瘤需要從多個(gè)靶點(diǎn)同時(shí)給藥才能起到良好的抑制療效。因此,針對雙/多靶點(diǎn)協(xié)同的抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)是抗癌新藥研發(fā)的熱點(diǎn)。
1. 硫氧還蛋白-1及抗癌藥物研究
硫氧還蛋白-1(Thioredoxin-1,Trx-1)是一種促進(jìn)腫瘤生長,抑制細(xì)胞凋亡,能上調(diào)低氧誘導(dǎo)因子HNF-1α和血管內(nèi)皮生長因子VEGF的低分子量的細(xì)胞氧化還原蛋白。在乳腺癌、宮頸癌、肺癌、肝癌,結(jié)直腸癌、胃癌和黑色素瘤等腫瘤病人的血液和癌組織中Trx-1的濃度都較正常人體中顯著升高。Trx-1在腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性方面發(fā)揮著重要的作用,如Trx-1含量越高的成人T細(xì)胞白血病細(xì)胞對阿霉素的敏感性越低,多烯紫杉醇敏感的MCF-7乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染Trx-1基因后對多烯紫杉醇耐藥,而敲低膀胱癌和前列腺癌細(xì)胞中Trx-1后顯著增加它們對絲裂霉素C的敏感性等。因此,Trx-1靶點(diǎn)是抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)的熱門靶點(diǎn)。
雖然目前臨床上還沒有針對該靶點(diǎn)的上市新藥,但是已有多個(gè)候選新藥正在臨床研究中。比如,由北京大學(xué)研發(fā)的乙烷硒啉正在進(jìn)行臨床II期研究(登記號CTR20140581),其是通過抑制硫氧還蛋白還原酶進(jìn)而抑制Trx-1水平,臨床定位胃癌、肺癌和結(jié)腸癌。莫特沙芬釓也是一種針對該靶點(diǎn)的候選新藥,目前正在進(jìn)行臨床III期,對腦癌具有顯著的療效。金諾芬是一種廣泛用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物,但研究發(fā)現(xiàn)其可通過Trx-1靶點(diǎn)對多種腫瘤發(fā)揮顯著療效,目前美國同步開展了4個(gè)臨床試驗(yàn)對金諾芬進(jìn)行抗腫瘤藥效的二次開發(fā)(臨床登記號NCT01419691,NCT01737502,NCT017477798和NCT03456700)。
PX-12(1-甲基丙基-2-咪唑基二硫醚)也是一種能抑制Trx-1的新藥分子,其分子中的二硫鍵是該藥物分子與Trx-1發(fā)生反應(yīng)的關(guān)鍵活性區(qū)域。-Cys-Gly-Pro-Cys-是Trx-1的保守催化位點(diǎn),其主要通過Cys32和Cys35兩個(gè)半胱氨酸殘基發(fā)揮功能。Trx-1能將這兩個(gè)半胱氨酸殘基氧化成二硫醚,進(jìn)而導(dǎo)致Trx-1失活,作用機(jī)制如下圖所示。
臨床前研究數(shù)據(jù)表明,PX-12對乳腺癌細(xì)胞MCF-7和胃腸道癌如結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29具有顯著的抑制作用。I期臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,PX-12能劑量依賴性有效降低多種腫瘤病人循環(huán)血液中Trx-1和VEGF水平,并與腫瘤病人的生存期具有明顯的相關(guān)性。按300 mg/m2/天的給藥劑量連續(xù)三天靜脈注射給與腫瘤病人志愿者,病人僅出現(xiàn)了1-2級的副作用,沒有出現(xiàn)3和4級的副作用,報(bào)道的副作用為可逆性缺氧和肺炎。以上結(jié)果提示,PX-12不但具有顯著的抑瘤效果,同時(shí)臨床副作用很小,顯示良好的抗腫瘤開發(fā)前景。
2. 端粒酶及抗癌藥物研究
端粒位于真核線性染色體末端,其作用是保持染色體的完整性和控制細(xì)胞分裂周期。由于“末端復(fù)制問題”、氧化損傷和其他復(fù)制相關(guān)的末端處理事件,端粒在正常體細(xì)胞每輪DNA復(fù)制中會逐漸縮短。端粒酶通過在細(xì)胞中的線性染色體末端添加六聚體端粒DNA(TTAGGG)重復(fù)來減少端粒縮短。因而,在端粒酶陰性的細(xì)胞中,因?yàn)槎肆?s短,細(xì)胞會進(jìn)行復(fù)制性衰老,但在端粒酶陽性的細(xì)胞中,細(xì)胞會永生化,有可能發(fā)展為癌癥。除了生殖細(xì)胞,干細(xì)胞,激活的淋巴細(xì)胞外,大多數(shù)正常的人體細(xì)胞不具有端粒酶活性,但在約85%至90%的原發(fā)性人類癌癥中幾乎普遍檢測到它。因此,通過抑制端粒酶活性就能抑制腫瘤的無限繁殖,許多的研究致力于尋找有效的端粒酶抑制劑。
國內(nèi)外針對端粒酶抑制劑的研究主要包括4個(gè)方面:抑制端粒酶活性,抑制端粒酶的疫苗,抑制端粒酶的病毒,以及破壞端粒完整性。目前,雖然還沒有針對端粒酶的上市藥物,但是已有多個(gè)候選藥物正在進(jìn)行臨床前研究和臨床各期試驗(yàn),分別是GRN163L,GV1001,GRNVAC1,G-quadruplex ligands和TERT promoter-driven oncolytic virus等。然而,這些候選藥物都是大分子化合物。
學(xué)術(shù)期刊Cancer Discovery(IF 26.37)報(bào)道了一種有效的小分子端粒酶抑制劑6-硫代-2'-脫氧鳥苷(6-thio-2′-deoxyguanosine,6-thio-dG),它可被端粒酶識別,并被整合到從頭合成的端粒中,導(dǎo)致端粒功能障礙,抑制腫瘤增殖(Cancer Discov, 2015, 5: 82-95)。這是至今為止報(bào)道的唯一一個(gè)小分子端粒酶抑制劑。據(jù)最新的Clarivate Analytics新藥研發(fā)進(jìn)度網(wǎng)站查詢,預(yù)計(jì)6-thio-dG將在2019年第3季度進(jìn)入臨床I期試驗(yàn)階段。已有的臨床前研究結(jié)果表明,6-thio-dG對I/O-、BRAF-、EGFR靶向治療難治性腫瘤具有廣泛的抑制作用,尤其對結(jié)直腸癌、肺癌、惡性黑色素瘤具有明顯的療效。特別是,在靶向分子療法中6-thio-dG能透過小鼠血腦屏障,選擇性殺死不可治愈類型兒童腦癌,包括固有橋腦膠質(zhì)瘤,高級膠質(zhì)瘤和高危髓母細(xì)胞瘤,表現(xiàn)出非常好的效果。
綜上所述, Trx-1和端粒酶在大多數(shù)腫瘤中的表達(dá)都顯著提高,因此針對這兩個(gè)靶點(diǎn)的抗癌藥物可能具有廣譜抗癌作用。由于腫瘤的異質(zhì)性,多靶點(diǎn)聯(lián)合用藥對大部分腫瘤特別是耐藥性腫瘤常表現(xiàn)明顯的效果,是臨床化療的主流方案。為此,我們提出了這樣一個(gè)假設(shè),能否將這兩種治療靶點(diǎn)設(shè)計(jì)在同一個(gè)化合物上,讓它同時(shí)具有Trx-1和端粒酶抑制作用,從而達(dá)到協(xié)同抑制腫瘤的效果呢?依據(jù)這一個(gè)思路,我們前期對PX-12和6-thio-dG母核進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾,獲得的新化合物對結(jié)直腸癌和黑色素瘤具有顯著的抑制作用,且經(jīng)評估成藥性好,具有良好的開發(fā)前景。
(二)項(xiàng)目主要研究開發(fā)內(nèi)容、關(guān)鍵技術(shù)及主要創(chuàng)新點(diǎn)。
1.研究成果和研發(fā)內(nèi)容
1.1.已有研究成果
按照上述研究思路,我們設(shè)計(jì)了4個(gè)目標(biāo)化合物,結(jié)構(gòu)如下:
對這些化合物初步的性狀研究發(fā)現(xiàn),它們?yōu)槿榘咨勰瑢廨^為穩(wěn)定。具有良好的溶解度,其中YLS004在水溶液中的溶解度遠(yuǎn)大于10 mg/mL,適合做成粉針劑。
體外機(jī)制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,這4個(gè)化合物都保留了較好的Trx-1活性抑制作用,其中YLS004的抑制作用與PX-12相當(dāng),結(jié)果見表1。同時(shí),YLS002和YLS004保留了與6-Thio-dG的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)抑制作用以及對DNA和端粒的損傷作用,作用略強(qiáng)于對照化合物,見圖1。以上結(jié)果表明,我們設(shè)計(jì)的化合物同時(shí)保留了Trx-1活性抑制和端粒酶抑制作用,與預(yù)期結(jié)果一致。
表1. 2-脫氧鳥苷類衍生物的Trx-1活性抑制作用
化合物
YLS001
YLS002
YLS003
YLS004
6-thio-dG
PX-12
克拉屈濱
IC50(μM)
31.71
9.78
47.73
4.26
>100
2.50
>100
圖1. YLS002和YLS004對端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的抑制以及對DNA和端粒的損傷作用。圖A和B為在人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和黑色素瘤細(xì)胞A375上YLS002和YLS004對TERT的抑制作用;圖C為對DNA和端粒的損傷作用。
以6-thio-dG、PX-12和上市結(jié)構(gòu)類似抗癌藥物克拉屈濱(Cladribine)作為陽性對照藥,受試化合物對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、SW620、HT29和人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375都具有顯著的抑制作用,特別是YLS004其抑制作用都優(yōu)于陽性對照藥物,而對正常結(jié)腸上皮細(xì)胞未表現(xiàn)抑制作用,結(jié)果見表2。而且,YLS004對HCT116和A375細(xì)胞的IC50值明顯低于6-Thio-dG+PX-12合用組,見圖2。該結(jié)果表明,YLS004體現(xiàn)了Trx-1和端粒酶抑制的顯著抑瘤協(xié)同作用。
表2. 2-脫氧鳥苷類衍生物的腫瘤細(xì)胞生長抑制作用
化合物
IC50(μM)
YLS001
YLS002
YLS003
YLS004
6-thio-dG
PX-12
克拉屈濱
NCM460
正常結(jié)腸上皮細(xì)胞
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
HCT116
人結(jié)腸癌細(xì)胞
1.27
2.66
21.82
1.09
17.50
34.54
28.45
SW620
人結(jié)腸癌細(xì)胞
0.21
1.71
5.43
0.11
>100
1.68
>100
HT29
人結(jié)腸癌細(xì)胞
4.55
3.02
7.37
4.24
3.04
3.37
9.44
A375
人惡性黑素瘤細(xì)胞
0.60
0.52
3.06
0.37
0.40
2.98
/
BGC
胃腺癌細(xì)胞
6.09
/
/
11.70
>100
/
/
K562
白血病細(xì)胞
9.885
10.134
28.732
15.732
23.342
21.657
7.863
HepG2
肝癌細(xì)胞
10~50
<10
10~50
<10
<10
10~50
/
A549
肺癌細(xì)胞
30.8
13.52
35.79
31.12
33.59
7.43
/
MCF7
乳腺癌細(xì)胞
/
15.56
/
41.31
>100
>100
>100
Bcap37
乳腺癌細(xì)胞
18.24
21.04
35.12
22.77
>100
>100
>100
注:/,表示未進(jìn)行該組實(shí)驗(yàn)。
圖2. YLS004與6-Thio-dG+PX-12合用組分別對HCT116和A375細(xì)胞的抑制作用。
體內(nèi)HCT116裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)給藥劑量以相同摩爾數(shù)給藥時(shí),與其他3個(gè)受試化合物相比,YLS004具有更好的腫瘤抑制作用,而且顯著優(yōu)于6-thio-dG和PX-12,見圖3。血液生化指標(biāo)顯示,該劑量下各組都未見明顯的毒性(見工作基礎(chǔ)4,表3)。以上體內(nèi)外的研究結(jié)果表明,YLS004的分子設(shè)計(jì)保留了Trx-1和端粒酶抑制作用,藥效上顯示了顯著的雙靶點(diǎn)協(xié)同抑瘤作用。
圖3. HCT116細(xì)胞荷瘤鼠模型給藥過程中各組裸鼠體重和腫瘤體積的變化
此外,我們采用人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375荷瘤鼠模型進(jìn)一步研究了YLS004對人惡性黑色素瘤的抑制作用。該實(shí)驗(yàn)以人惡性黑色素瘤的臨床一線用藥達(dá)卡巴嗪(Dacarbazine,DITC)為陽性對照藥物(其給藥劑量為20.40 mg/kg,相當(dāng)于10 mg/kg YLS004給藥劑量摩爾數(shù)的4倍),同時(shí)設(shè)置了6-thio-dG + PX-12聯(lián)合用藥組(給藥劑量與10 mg/kg YLS004等摩爾劑量)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),按摩爾數(shù)計(jì)算,YLS004給藥劑量為陽性對照藥DITC給藥劑量的四分之一時(shí),其抑瘤作用都顯著高于DITC,而且其抑瘤作用也顯著高于同摩爾給藥劑量下6-thio-dG和PX-12聯(lián)合用藥組(見圖4)。該結(jié)果表明,YLS004的抑制人惡性黑色素瘤活性要顯著高于臨床一線用藥DITC,而且從大鼠體重來看,雖然給藥初期YLS004組體重下降較快,但是給藥6天后體重開始逐漸升高,到給藥13天后,體重明顯超過DITC組、6-thio-dG和PX-12聯(lián)合用藥組,表明連續(xù)給藥后機(jī)體能快速逆轉(zhuǎn)該毒性。此外,從與6-thio-dG和PX-12聯(lián)合用藥組的抑瘤作用和體重變化相比,YLS004比聯(lián)合用藥組抑瘤作用顯著增加,而且毒性更低。在ICR小鼠上以25 mg/kg/天的給藥劑量連續(xù)給藥5天后,僅在造血系統(tǒng)和脾臟發(fā)現(xiàn)了輕微的毒性(見工作基礎(chǔ)7)。以上結(jié)果說明,YLS004的對人惡性黑色素瘤的抑瘤作用和毒性都顯著優(yōu)于6-thio-dG+PX-12兩種藥物的同摩爾劑量物理組合以及臨床一線用藥DITC(4倍摩爾劑量),同樣體現(xiàn)了雙靶點(diǎn)的顯著協(xié)同抑瘤作用。
圖4. YLS004對A375細(xì)胞荷瘤鼠模型給藥過程中各組裸鼠體重和腫瘤體積的變化
Trx-1和端粒酶在多種腫瘤細(xì)胞中都高表達(dá),它們對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展都起著重要的促進(jìn)作用。本項(xiàng)目設(shè)計(jì)的目標(biāo)分子將Trx-1抑制劑和端粒酶抑制劑的共能基團(tuán)巧妙的設(shè)計(jì)在一起,獲得了同時(shí)具有Trx-1抑制和端粒酶抑制作用的全新小分子化合物YLS004,體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明其對結(jié)直腸癌和惡性黑色素瘤有非常顯著的抑制作用,且毒性低。大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究數(shù)據(jù)表明,大鼠靜脈注射YLS004后其在大鼠體內(nèi)能生成代謝物6-thio-dG,請見工作基礎(chǔ)6。因此,YLS004的體內(nèi)藥代動力學(xué)過程和藥效作用都符合我們對該類分子設(shè)計(jì)的思路,如下圖所示。相關(guān)研究成果已經(jīng)申請國家發(fā)明專利(專利名稱:6-雙硫取代-2’-脫氧鳥苷類化合物及其制備方法和應(yīng)用,專利申請?zhí)?01811003442.6)。
據(jù)2019年1月發(fā)布的癌癥報(bào)告,我國2015年(統(tǒng)計(jì)報(bào)告晚3年)結(jié)直腸癌的發(fā)病人數(shù)是38.7萬人,死亡人數(shù)為21.5萬人。我國是全球胃腸道癌癥的高發(fā)區(qū),近幾年結(jié)直腸癌的發(fā)病人數(shù)據(jù)估算已經(jīng)遠(yuǎn)超該數(shù)值。目前臨床上結(jié)直腸癌的常用治療方案是5-FU聯(lián)合奧沙利鉑或伊立替康,但效果都不佳,特別是對中晚期病人。因此,結(jié)直腸癌新藥的市場前景非常好。惡性黑色素瘤雖然臨床上發(fā)病率較低,但轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤目前臨床上沒有好的治療手段,一線用藥達(dá)卡巴嗪療效有限且毒副作用大。因此,開發(fā)療效好、毒副作用低的結(jié)直腸癌和黑色素瘤治療藥物非常必要,同時(shí)也具有廣闊的市場前景。
1.2.研發(fā)內(nèi)容
本項(xiàng)目在前期部分成藥性評價(jià)基礎(chǔ)上,將按照新藥臨床前研究指導(dǎo)原則,對候選化合物YLS004開展系統(tǒng)的藥學(xué)、藥效學(xué)、安全性評價(jià)、藥代動力學(xué)研究,內(nèi)容如下:
(1)藥學(xué)研究:利用正交試驗(yàn)優(yōu)化YLS004的合成工藝,確定工藝參數(shù),確定中試工藝研究;開展質(zhì)量研究,制定藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),并開展化合物的穩(wěn)定性研究;完善YLS004的制劑處方、工藝優(yōu)化、確定制劑生產(chǎn)工藝參數(shù),進(jìn)行制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。
(2)作用機(jī)制和藥效學(xué)研究:采用重組酶、穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞系、基因Knockdown和化學(xué)抑制劑等技術(shù)開展Trx-1和端粒酶雙靶點(diǎn)抑制研究,進(jìn)一步明確作用機(jī)制;按照抗腫瘤新藥藥效學(xué)研究規(guī)范,以5-FU/奧沙利鉑和達(dá)卡巴嗪等為陽性藥物,以結(jié)直腸癌細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞(包括耐藥株)體外模型以及荷瘤鼠模型和PDX模型,系統(tǒng)研究YLS004對結(jié)直腸癌和黑色素瘤的抑瘤效果,獲得劑量-藥效關(guān)系。
(3)藥代動力學(xué)研究:考察YLS004的代謝穩(wěn)定性以及在動物體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄等PK特性,考察其對細(xì)胞色素P450酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響從而評估可能的藥物相互作用。
(4)一般藥理學(xué)研究:考察在有效劑量下,YLS004對動物的神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等的作用。
(5)安全性評價(jià)研究:完成急性毒性實(shí)驗(yàn)(大鼠和犬)、長期毒性試驗(yàn)(6,12個(gè)月,大鼠和犬)、溶血性、局部刺激性、過敏性試驗(yàn)等,評價(jià)YLS004可能的毒性;進(jìn)行毒代動力學(xué)研究。
2.關(guān)鍵技術(shù):
(1)目標(biāo)化合物的高效合成技術(shù)——針對二硫鍵基團(tuán)發(fā)展YLS004的綠色高效合成技術(shù),簡化合成工藝,使用廉價(jià)、滿足新藥申報(bào)要求的原料,提高合成總收率、減少污染排放,滿足新藥申報(bào)要求。
(2)硫氧還蛋白和端粒酶抑制機(jī)制和藥效評價(jià)技術(shù)——構(gòu)建重組酶、穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞系、基因Knockdown等模型研究YLS004對硫氧還蛋白和端粒酶雙靶點(diǎn)抑制的協(xié)同作用機(jī)制,評價(jià)量效關(guān)系。
3. 主要創(chuàng)新點(diǎn)
(1)該項(xiàng)目通過巧妙的分子設(shè)計(jì),使得Trx-1和端粒酶兩個(gè)熱門抗癌藥效靶點(diǎn)在一個(gè)分子上同時(shí)實(shí)現(xiàn)抑制,在細(xì)胞和動物模型上獲得了對結(jié)直腸癌、惡性黑色素瘤等腫瘤效果顯著的目標(biāo)化合物YLS004,其藥效明顯優(yōu)于而毒性明顯低于在研的Trx-1抑制劑、6-thio-dG以及臨床一線用藥。
(2)YLS004具有全新分子結(jié)構(gòu),已申報(bào)國家發(fā)明專利(6-雙硫取代-2’-脫氧鳥苷類化合物及其制備方法和應(yīng)用,專利申請?zhí)?01811003442.6)和PCT(美國)專利,具有完全自主知識產(chǎn)權(quán)。
浙江大學(xué)
2021-05-10