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一步酶法從頭孢菌素 c（CPC） 生產(chǎn) 7－氨基頭孢烷酸（ 7-ACA） 是繼我們研發(fā)的兩步酶法工藝成功應(yīng)用于工1 成果簡介一步酶法從頭孢菌素 c（CPC） 生產(chǎn) 7－氨基頭孢烷酸（ 7-ACA） 是繼我們研發(fā)的兩步酶法工藝成功應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)以后，在生產(chǎn)頭孢菌素類抗生素醫(yī)藥中間體技術(shù)的又一個突破。與化學法和兩步酶法相比，一步酶法有工藝簡單、環(huán)保和轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品質(zhì)量好等優(yōu)點。該技術(shù)采用基因工程技術(shù)對 CPC 酰化酶（一步酶法用酶）的基因進行了改造，獲得了能夠高效催化 CPC 到 7-ACA 的突變基因。通過我們自己構(gòu)建的高效啟動子 HP 以及優(yōu)化組合的調(diào)控表達元件，構(gòu)建并篩選出了能夠高效、高活性表達一步酶法用酶——CPC 酰化酶的基因工程細胞株。這是國內(nèi)第一個使得 CPC 酰化酶活性能夠達到工業(yè)應(yīng)用水平的技術(shù)。由于采用了高效的表達系統(tǒng)和穩(wěn)定的質(zhì)粒，以及組成型表達結(jié)構(gòu)，使得該基因工程菌遺傳特性非常穩(wěn)定，在發(fā)酵制酶的過程中不需要添加任何抗生素和誘導劑就可以實現(xiàn)高效、高活性表達。在高效表達 CPC 酰化酶的基礎(chǔ)上，我們通過在表達基因上同時引入的特殊基因序列，使得蛋白的純化和固定化工藝一步進行。通過自己開發(fā)研制的可重復使用的固定化載體，可以使得固定化酶活性達到 60U/g 以上。 采用我們研制的特異性純化介質(zhì)，可以從菌體破碎液中一步純化和固定化 CPC 酰化酶，酶收率在 90 ％以上，固定化酶活達到 60U/g 以上。固定化酶可以重復使用 20 批以上，純化和固定化用載體可以重復使用。2 技術(shù)指標菌 種：基因工程大腸桿菌，卡那抗性，組成型表達。 發(fā)酵溫度： 37℃ 培 養(yǎng) 基：普通的大腸桿菌培養(yǎng)基，主要成分有玉米漿等廉價的營養(yǎng)源。 發(fā)酵周期： 20 小時 發(fā)酵酶活： 3U/ml 以上（ 5 升發(fā)酵罐） 特 點：遺傳特性穩(wěn)定，不需要添加誘導劑和抗生素，工藝簡單。3 合作方式小試技術(shù)轉(zhuǎn)讓或合作進行中試。4 所屬行業(yè)領(lǐng)域醫(yī)療衛(wèi)生。業(yè)生產(chǎn)以后，在生產(chǎn)頭孢菌素類抗生素醫(yī)藥中間體技術(shù)的又一個突破。與化學法和兩步酶法相比，一步酶法有工藝簡單、環(huán)保和轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品質(zhì)量好等優(yōu)點。該技術(shù)采用基因工程技術(shù)對 CPC 酰化酶（一步酶法用酶）的基因進行了改造，獲得了能夠高效催化 CPC 到 7-ACA 的突變基因。通過我們自己構(gòu)建的高效啟動子 HP 以及優(yōu)化組合的調(diào)控表達元件，構(gòu)建并篩選出了能夠高效、高活性表達一步酶法用酶——CPC 酰化酶的基因工程細胞株。這是國內(nèi)第一個使得 CPC 酰化酶活性能夠達到工業(yè)應(yīng)用水平的技術(shù)。由于采用了高效的表達系統(tǒng)和穩(wěn)定的質(zhì)粒，以及組成型表達結(jié)構(gòu)，使得該基因工程菌遺傳特性非常穩(wěn)定，在發(fā)酵制酶的過程中不需要添加任何抗生素和誘導劑就可以實現(xiàn)高效、高活性表達。在高效表達 CPC 酰化酶的基礎(chǔ)上，我們通過在表達基因上同時引入的特殊基因序列，使得蛋白的純化和固定化工藝一步進行。通過自己開發(fā)研制的可重復使用的固定化載體，可以使得固定化酶活性達到 60U/g 以上。 采用我們研制的特異性純化介質(zhì)，可以從菌體破碎液中一步純化和固定化 CPC 酰化酶，酶收率在 90 ％以上，固定化酶活達到 60U/g 以上。固定化酶可以重復使用 20 批以上，純化和固定化用載體可以重復使用。

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在非活化烯烴官能團化方面的研究進展：含α-季碳中心的手性胺是許多有生物活性化合物和重要藥物的結(jié)構(gòu)單元，該結(jié)構(gòu)單元的不對稱合成一直以來是充滿挑戰(zhàn)性的課題：需要克服季碳中心的空間位阻和控制與之相連的四個取代基的正確方向。劉心元、譚斌課題組利用質(zhì)子酸（布蘭斯特酸）催化非活化烯烴的不對稱胺氫化反應(yīng)，合成了含季碳中心的α-吡咯烷類化合物。此項研究成果在國際上首次實現(xiàn)了通過不對稱胺氫化反應(yīng)構(gòu)建含有季碳中心的含N雜環(huán)化合物，該工作通過在底物中引入硫脲基團，該基團在手性磷酸（布蘭斯特酸）催化下可活化非活化烯烴和控制手性的季碳中心的形成。該方反應(yīng)具有操作簡單，產(chǎn)率高，官能團耐受性好，綠色環(huán)保（非金屬催化的）等優(yōu)點，可以很方便轉(zhuǎn)化為各種具有潛在生物活性的螺環(huán)的含季碳中心的α-吡咯烷類化合物。