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本發(fā)明涉及一種利用噬菌體PhiX174的E基因和葡萄球菌核酸酶A基因轉(zhuǎn)化制備鴨疫里默氏菌前菌影疫苗的方法與應(yīng)用方法。該方案首先將噬菌體PhiX174的E基因和葡萄球菌核酸酶A基因通過(guò)柔性連接臂(Gly4Ser)3連接成串聯(lián)基因，并進(jìn)一步構(gòu)建溫控表達(dá)載體pBV-E-SN。將pBV-E-SN電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入鴨疫里默氏菌原生質(zhì)體，篩選陽(yáng)性克隆28℃增菌培養(yǎng)。分離菌體加保護(hù)劑后分裝、冷凍干燥。本發(fā)明所制備的活菌疫苗經(jīng)飲水免疫，既可以刺激呼吸道和消化道黏膜的局部免疫，也可以激發(fā)體液免疫。

茶葉是我國(guó)重要的農(nóng)產(chǎn)品之一， 也是傳統(tǒng)的大宗出口商品。在茶葉種植中，以氯氝菊酣為主

成果與項(xiàng)目的背景及主要用途： 菌糠是指以棉籽殼、木屑、稻草、玉米芯、甘蔗渣及多種農(nóng)作物秸稈、工業(yè) 廢料（如酒糟、醋糟、造紙廠廢液及制藥廠黃漿廢液等）為主要原料栽培食用菌 后的廢棄培養(yǎng)基。菌糠主要含有物質(zhì)是纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、抗?fàn)I養(yǎng)因子 和少量的蛋白質(zhì)，這些原料作為培養(yǎng)基栽培食用菌后，通過(guò)食用菌菌體的生物固 氮作用、酶解作用等一系列生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量均比不經(jīng)過(guò)食 用菌發(fā)酵前提高二倍以上，纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等均已被不同程度的降解， 其中粗纖維素降低了 50%以上，木質(zhì)素降低 30%以上，棉酚降低 60%以上，同 時(shí)還產(chǎn)生了多種糖類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)和生物活性物質(zhì)。據(jù)報(bào)道，我國(guó)菌糠年產(chǎn)量在 200 萬(wàn)噸以上大部分當(dāng)作廢料而被浪費(fèi)掉，給環(huán)境造成了很大的污染，一些菌糠 可以被用作畜禽飼料，并且用廢棄菌糠來(lái)改良土壤可以做到廢物利用、改善環(huán)境， 實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。 我國(guó)土壤絕大部分嚴(yán)重缺磷、缺鉀，化學(xué)肥料中的磷元素和鉀元素在施肥后 很快被固化，不再能夠被植物使用。解磷菌、解鉀菌及固氮菌是生物益生菌肥中 的主要菌株，使用這些土壤益生菌可以提高土壤中植物可利用氮磷鉀的利用率。 如果能夠利用廢棄菌糠大規(guī)模培養(yǎng)這三種菌，制備成為生物菌肥，將會(huì)極大的增 211天津大學(xué)科技成果選編 加菌糠做為肥料的優(yōu)勢(shì)。本項(xiàng)目利用菌糠培養(yǎng)解磷菌、解鉀菌、固氮菌，制備成 為生物菌肥，預(yù)期產(chǎn)生極大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。 技術(shù)原理與工藝流程簡(jiǎn)介： 本項(xiàng)目擬利用處理后的廢棄菌糠殘?jiān)囵B(yǎng)酵母、解磷菌、解鉀菌、固氮菌， 優(yōu)化發(fā)酵條件，提高菌體量，獲得制備微生物菌肥的最佳工藝路線。 天津大學(xué)從農(nóng)業(yè)廢棄物堆肥中篩選出 7 株解磷能力較強(qiáng)的菌株，其中菌株 FL7 表現(xiàn)出較好的解磷效果，F(xiàn)L7 解磷量為 436.63mg/L。該菌株已經(jīng)于 2010 年 7 月 13 日在中國(guó)微生物菌種保藏中心進(jìn)行保藏（保藏號(hào)：CGMCC NO.4008）。 本課題組還從農(nóng)業(yè)廢棄物堆肥中篩選得到解鉀菌 K3、固氮菌 N1。解鉀菌 K3 解 鉀量達(dá) 4.10mg/L、固氮菌 N1 固氮量為 1.81×10—2mol/L。 另外，天津大學(xué)已經(jīng)建立了以菌糠為基質(zhì)培養(yǎng)解磷、解鉀、固氮菌的發(fā)酵條 件，經(jīng)過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化，制備的菌肥中三種菌的含量達(dá)到 48.62×108CFU/g，其 中解磷菌 2.4×108cfu/g，解鉀菌 25.22×108cfu/g，固氮菌 21×108cfu/g，均遠(yuǎn)高于 國(guó)標(biāo)。 應(yīng)用領(lǐng)域：生物、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域 合作方式及條件：具體面議

有很高的食用和藥用價(jià)值，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥用真菌之一。其鮮嫩醇香，肉 質(zhì)細(xì)嫩、潔白如玉、口感獨(dú)特、生熟皆可食、食藥兩用、營(yíng)養(yǎng)豐富。雞樅菌中 含有麥角甾醇類(lèi)物質(zhì)及治療糖尿病的有效成份，對(duì)降低血糖有明顯效果。并有 抑制人體癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。 

本發(fā)明的目的在于提供了一種裝載具有干擾素誘導(dǎo)活性的聚肌胞苷酸，并加入殼寡糖作為佐劑的鴨疫里默氏菌菌影疫苗。該方案首先構(gòu)建溫控表達(dá)載體，電轉(zhuǎn)化入鴨疫里默氏菌原生質(zhì)體，篩選陽(yáng)性克隆后28℃增菌培養(yǎng)，然后42℃誘導(dǎo)裂解基因的表達(dá)，待OD600不再降低時(shí)，加入聚賴(lài)氨酸繼續(xù)作用以充分裂解活菌，然后離心分離菌體。將干燥菌體與6mg/mL的聚肌胞溶液等比例混合，使聚肌胞包埋進(jìn)入菌影內(nèi)，然后加入2%殼寡糖水溶液攪拌形成均一的混合物，分裝于西林瓶，冷凍干燥，即得到鴨疫里默氏菌新型菌影疫苗。本發(fā)明所制備的菌影疫苗經(jīng)飲水免疫，既可以刺激呼吸道和消化道黏膜的局部免疫，也可以激發(fā)體液免疫，對(duì)機(jī)體的保護(hù)效果與注射免疫無(wú)明顯差異。

鹽脅迫直接影響植物的生長(zhǎng)，我國(guó)現(xiàn)有約9913萬(wàn)公頃的鹽堿土地，占全國(guó)可用耕地面積近四分之一，無(wú)法進(jìn)行大規(guī)模農(nóng)作物種植。植物耐鹽堿促生菌可以通過(guò)調(diào)節(jié)土壤pH值，促進(jìn)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，調(diào)節(jié)植物激素，調(diào)節(jié)植物耐受氧化和滲透脅迫的能力等，幫助植物抵抗鹽堿脅迫在逆境下生長(zhǎng)增產(chǎn)。 對(duì)于耐鹽堿促生菌Bacillus subtilis N51和Bacillus cereus T146，實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)通過(guò)連續(xù)發(fā)酵，優(yōu)化發(fā)酵工藝以及噴霧干燥工藝，制備孢子形成率達(dá)70%以上、干粉菌劑活菌數(shù)目達(dá)1010/g的菌劑。 對(duì)于菌株Kocuria sp. LA1T6、Bacillus sp. LA1T8和Pseudomonas sp.T44，實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)進(jìn)行多糖包衣制劑的開(kāi)發(fā)，研制高穩(wěn)定性、成膜性、安全性和緩釋性的包衣制劑。

技術(shù)分析（創(chuàng)新性、先進(jìn)性、獨(dú)占性） （1）耐藥菌感染已經(jīng)成為危害公共安全和人類(lèi)健康的重大疾病 近年來(lái)，隨著抗菌藥物的增加和廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題日益突出，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、耐青霉素肺炎鏈球菌(PRSP)、耐萬(wàn)古霉素腸球菌(VRE)、產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)腸桿菌、多種耐藥性結(jié)核桿菌(MDRMT) 等超級(jí)耐藥致病菌相繼產(chǎn)生和擴(kuò)散，嚴(yán)重危害公共安全和威脅人類(lèi)健康，減少耐藥菌株的生成和研制新的抗菌藥物不僅成為醫(yī)藥界必須解決的重大問(wèn)題，而且引起了國(guó)際社會(huì)和各國(guó)政府的高度關(guān)注。2014年，WHO首次發(fā)布了全球抗生素耐藥報(bào)告；2016年，聯(lián)合國(guó)在紐約聯(lián)合國(guó)總部召開(kāi)“抗生素耐藥性問(wèn)題高級(jí)別會(huì)議”，WHO再次發(fā)布報(bào)告，全面審視了全球的耐藥菌情況。2016年在杭州舉行的二十國(guó)集團(tuán)（G20）領(lǐng)導(dǎo)人峰會(huì)，專(zhuān)門(mén)提出要推動(dòng)全球應(yīng)對(duì)抗生素耐藥性問(wèn)題。美國(guó)、中國(guó)等國(guó)家高度重視耐藥菌的危害和防控，美國(guó)政府2015年制定了為期5年的抗擊耐藥細(xì)菌國(guó)家行動(dòng)計(jì)劃；中國(guó)政府制定了《遏制細(xì)菌耐藥國(guó)家行動(dòng)計(jì)劃（2016 —2020 年）》。耐藥菌感染，已經(jīng)成為危害世界公共安全和人類(lèi)健康的重大疾病。 （2）中醫(yī)藥防治感染性疾病具有確切的療效和明顯的優(yōu)勢(shì) 感染性疾病在中醫(yī)典籍中常被稱(chēng)為外感疾病，有外感熱病、傷寒、溫病、溫疫等稱(chēng)謂。幾千年來(lái)，中醫(yī)藥為中國(guó)人民的健康，尤其是在預(yù)防和控制感染疾病方面做出了重大貢獻(xiàn)。中藥藥效物質(zhì)研究是中藥實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代化和國(guó)際化的突破口，《“十三五”中醫(yī)藥科技創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)規(guī)劃》明確了中藥藥效物質(zhì)研究是國(guó)家中長(zhǎng)期重點(diǎn)關(guān)注的內(nèi)容之一，強(qiáng)調(diào)發(fā)展前沿關(guān)鍵技術(shù)與創(chuàng)新方法的重要性；同時(shí)要求在中醫(yī)藥原創(chuàng)思維的指導(dǎo)下，加強(qiáng)系統(tǒng)生物學(xué)、合成化學(xué)、大數(shù)據(jù)等多學(xué)科前沿技術(shù)與中醫(yī)藥的深度交叉融合，促進(jìn)中醫(yī)藥研究策略的優(yōu)化和復(fù)雜系統(tǒng)研究方法學(xué)上的變革，解決當(dāng)前中醫(yī)藥的研究瓶頸問(wèn)題。 （3）項(xiàng)目建立了中藥防治耐藥菌創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)新模式 項(xiàng)目建立了以“方-病證-菌”、“藥-病證-菌”、“有效部位-病證-菌”、“有效成分-病證-菌”和“結(jié)構(gòu)-網(wǎng)絡(luò)-靶標(biāo)”的中藥防治耐藥菌創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)的新模式，建立了抗耐藥菌創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)與評(píng)價(jià)的技術(shù)體系和平臺(tái)，為解決日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性問(wèn)題提供新思路、建立新體系、開(kāi)發(fā)新藥物。 抗耐藥菌創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)新平臺(tái) 項(xiàng)目建立中藥防治耐藥菌創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)新模式，基于計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的防治耐藥菌創(chuàng)新中藥發(fā)現(xiàn)；基于高通量高內(nèi)涵篩選的防治耐藥菌創(chuàng)新中藥發(fā)現(xiàn)；基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的防治耐藥菌創(chuàng)新中藥發(fā)現(xiàn)；基于新靶點(diǎn)的防治耐藥菌創(chuàng)新中藥發(fā)現(xiàn)，突破了中藥防治耐藥菌新品種的評(píng)價(jià)技術(shù)：基于病證菌模型的創(chuàng)新中藥評(píng)價(jià)；基于毒效整合的創(chuàng)新中藥評(píng)價(jià)。 （4）篩選出中藥防治耐藥菌候選藥物兩個(gè) ① 基于“方-病證-菌”、“藥-病證-菌”、“有效部位-病證-菌”理念篩選出中藥五類(lèi)新藥1個(gè)-廣藿香油 通過(guò)前期對(duì)大量中藥方劑抗耐藥菌活性進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)廣藿香在大量具有抗耐藥菌活性的中藥方劑中都有出現(xiàn)，初步活性測(cè)試也表明，中藥廣藿香具有較強(qiáng)的抗耐藥菌效價(jià)。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)廣藿香水提物和醇提物的抗耐藥菌效果遠(yuǎn)不如廣藿香油，因此廣藿香油是廣藿香抗耐藥菌活性的有效部位。 廣藿香油的藥效學(xué)研究 針對(duì)廣藿香油能“芳香化濕”治療陰道炎的臨床應(yīng)用，我們通過(guò)構(gòu)建家兔陰道炎模型、大小鼠陰道炎模型、原發(fā)性痛經(jīng)模型、斑馬魚(yú)血管損傷模型、多種動(dòng)物離體子宮模型等，通過(guò)細(xì)菌篩選、細(xì)胞篩選等試驗(yàn)平臺(tái)，借助超高分辨率激光共聚焦顯微鏡、高內(nèi)涵成像系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀等先進(jìn)設(shè)備對(duì)廣藿香油治療陰道炎的物質(zhì)基礎(chǔ)、量效關(guān)系、藥理作用機(jī)理等進(jìn)行了研究，表明廣藿香油對(duì)于陰道炎具較好的治療效果。隨后項(xiàng)目對(duì)廣藿香油栓劑的制備工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案等進(jìn)行了研究制定，并對(duì)藥理作用與毒理進(jìn)行了評(píng)價(jià)。 ② 基于“有效成分-病證-菌”理念篩選出抗耐藥菌新藥1個(gè)-廣藿香酮共軛取代衍生物（CDPC-B7）片劑 廣藿香酮是廣藿香油的有效成分之一，具有多種生物活性，包括胃腸道調(diào)節(jié)功能、抗炎和抗菌等作用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，廣藿香酮能夠抑制白色念珠菌（Candida albicans）、新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）、黑根霉菌（Rhizopus nigricans）和其他真菌，體內(nèi)研究表明對(duì)大腸埃希菌（E. coli）和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）均有抑制作用。而且，廣藿香酮單體對(duì)棒狀桿菌和金黃桿菌的最小抑菌濃度小于0.098 μg/mL。經(jīng)藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，廣藿香酮具有良好的口服吸收效果。 為了進(jìn)一步優(yōu)化藥物抑菌療效，降低毒副作用，我們利用分子對(duì)接以及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等方法，研究了廣藿香酮復(fù)雜的抗菌作用機(jī)制和抗菌作用的靶點(diǎn)。并通過(guò)基于靶點(diǎn)藥物設(shè)計(jì)方法，針對(duì)性的設(shè)計(jì)了一類(lèi)能與靶點(diǎn)緊密結(jié)合的廣藿香酮?jiǎng)?chuàng)新衍生物，并通過(guò)借助有機(jī)合成方法學(xué)手段對(duì)化合物合成工藝進(jìn)行了設(shè)計(jì)和優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了創(chuàng)新廣藿香酮衍生物庫(kù)的構(gòu)建。隨后通過(guò)抗菌活性驗(yàn)證、片劑制備工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案等進(jìn)行了研究制定，并對(duì)藥理作用與毒理進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

該技術(shù)屬于微生物農(nóng)藥行業(yè)，使用的是專(zhuān)利菌種，制備工藝重 點(diǎn)解決了黃色籃狀菌分生孢子的發(fā)酵培養(yǎng)和與普通助劑生物相容性差的技術(shù)難 題，目前國(guó)內(nèi)沒(méi)有相關(guān)制劑研究和開(kāi)發(fā)。本技術(shù)優(yōu)化了發(fā)酵條件，在配方中選 用了生物相容性好的助劑和保護(hù)劑，產(chǎn)品穩(wěn)定性好。生產(chǎn)加工操作相對(duì)容易； 黃色籃狀菌可濕性粉劑具備制劑穩(wěn)定，使用、貯存及運(yùn)輸方便等特點(diǎn)。黃色籃 狀菌可濕粉劑對(duì)花生、棉花等多種作物土傳病害防效顯著，防治對(duì)象不容易產(chǎn)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)科技成果介紹 2017 －57－ 生抗藥性，對(duì)人畜及天敵安全，是生產(chǎn)無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品的首選藥劑，經(jīng)在花生和 棉花上應(yīng)用，盆栽試驗(yàn)防病效果 85%以上；田間試驗(yàn)防病效果 60%以上，增產(chǎn) 10% 以上。 

氟嘧菌酯是農(nóng)藥殺菌劑，廣泛用于治療水稻，小麥，馬鈴薯，蔬菜，咖啡等作物的枯葉 病。氟嘧菌酯的商標(biāo)名為，中文商品名，國(guó)外專(zhuān)利即將到期。 本課題組已完成氟嘧菌酯原料藥合成，工藝路線先進(jìn)，有成本和環(huán)保優(yōu)勢(shì)，利潤(rùn)空間大。 目前在進(jìn)行制劑研究，計(jì)劃進(jìn)行國(guó)家批文申請(qǐng)。