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一種基因工程紅球菌及其構建方法與應用

1. 痛點問題紅球菌是具有高抗逆性（耐有機溶劑、耐高溫、耐酸堿）的特殊放線菌，日本30年前首先使用紅球菌高效催化丙烯腈水合生產丙烯酰胺——其聚合產物廣泛用于石油開采、水處理、土壤改良劑等領域——迄今為止仍是工業(yè)生物技術領域最成功的案例之一。開發(fā)紅球菌基因編輯方法，一方面可以實現(xiàn)紅球菌細胞自身性能的按需調控（如敲除副產物基因），解決丙烯酰胺、丙烯酸銨等酰胺、羧酸類大宗/精細化學品生產中的高成本和高排放問題，另一方面有望以紅球菌細胞為普適性宿主，高表達各種外源功能酶，從而實現(xiàn)重組紅球菌全細胞催化技術的普遍應用，尤其是解決手性醫(yī)藥中間體現(xiàn)有制備工藝中路線長、工藝復雜、原子經濟性差、環(huán)境污染嚴重等各種主要問題。但是，作為一種革蘭氏陽性放線菌，紅色紅球菌存在基因組中GC含量高、基因轉化率低、非法重組嚴重等問題，基因組改造困難。目前紅色紅球菌基因組改造主要依賴于自殺質粒介導的同源重組，但自殺質粒轉化效率和單交換成功率很低，正確編輯率更低。因此，迫切需要開發(fā)高效的紅球菌基因組編輯工具。 2. 解決方案本技術核心成果是一種基于CRISPR（成簇規(guī)律間隔短回文序列）-Cas9（DNA剪切蛋白）技術的紅色紅球菌基因組高效編輯方法。該技術通過紅色紅球菌特有啟動子及質粒元件，首先實現(xiàn)了Cas9蛋白在紅色紅球菌中的表達及切割功能；其次成功規(guī)避了紅球菌的限制修飾系統(tǒng)，將紅色紅球菌基因轉化效率提高了80多倍；接下來，又通過紅球菌重組酶的引入，顯著提高了外源基因在紅色紅球菌中的同源重組效率，最終率先成功建立紅色紅球菌的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，不僅可以實現(xiàn)基因組上目標基因的敲除、替換和改造，也可實現(xiàn)多個基因的同時敲除以及無痕疊加敲除，為紅球菌全細胞催化平臺技術開發(fā)及其在化學品綠色先進制造中的應用奠定了堅實基礎。合作需求開展合作開發(fā)、技術許可等，尋求有志于生物制藥、生物合成、石油開采、日化洗滌等不同應用領域進行紅球菌全細胞催化法生產目標產品的企業(yè)合作，尤其是在上述不同領域具有生產和銷售優(yōu)勢或經驗的企業(yè)。

清華大學 2021-12-16

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