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成果簡介： 飼料級微生態制劑在我國的研究與利用起步較遲，主要存在客戶成本投入大，產品穩定性差，活菌含量低等問題。針對以上問題，本成果利用現代生物技術手段，完成了自主知識產權的飼料級芽孢桿菌和乳酸菌發酵及高密度活菌包埋技術研究。成果對飼料級芽孢桿菌和乳酸菌發酵條件進行優化，利用補料流加技術對其進行高密度培養，提高菌體的發酵密度，使發酵后的有效活菌數達到1×

成果簡介：  益生芽孢桿菌因其獨特的優勢可用來制成新型、高效、低殘留的微生態制劑，廣泛應用于工業、農業、醫學等科學研究領域。目前，國內外益生芽孢桿菌產業化關鍵技術存在諸多問題。如：活菌數低、出芽率低、貨架期短、生產工藝研究不夠深入、產品穩定性差等。 項目組在完成系列國家及省部級項目

益生優良芽孢桿菌是一類能對熱、紫外線、電磁輻射等有強抗性的微生物。其獨特優勢可用來制成新型、高效、低殘留的微生態制劑，廣泛應用于工業、農業、醫學等研究領域。目前，國內外益生芽孢桿菌產業化關鍵技術存在諸多問題。如：產品中活菌數低；有效期內活菌含量低造成貨架期短；研發與生產脫節，研發單位工程技術應用相對滯后。針對當前問題，本技術攻克了芽孢桿菌發酵集成技術，包括： （1）N+離子誘變結合熒光探針追蹤：利用低能離子注入技術對芽孢桿菌進行改良，篩選出性狀優良的菌種。通過熒光探針追蹤芽孢桿菌培養

（一）蠟樣芽孢桿菌蠟樣芽孢桿菌NJYH63305是團隊自行篩選的有益芽孢桿菌，廣泛應用于農業、醫藥、食品保健、飼料等領域。在農業領域，是一種集抑菌、殺蟲、促生于一體的環境友好型高效生防制劑，對茶輪斑病菌、黃瓜枯萎病菌、立枯絲核菌、煙草赤星病菌、茶云紋葉枯病菌、小麥全蝕病菌、小麥紋枯病、尖鐮孢菌、鐮刀菌、終極腐霉菌等植物病害及小菜蛾具有較強抑制作用。在醫藥領域，可調節人體腸道微生態平衡，適于治療急慢性痢疾、腸炎、腹瀉、嬰幼兒腹瀉引起的腸功能紊亂等；在食品保健領域，可作為食品添加劑，長期服用能促進營養物質的消化吸收，減少腸道疾病的發生，提高免疫能力、增強抗病能力。 1、蠟樣芽孢桿菌國內外研究進展目前，國內外蠟狀芽孢桿菌研究大多處于實驗室內研究階段，其商品化并應用于農業防治的實例較少。國內市場上蠟樣芽孢桿菌農用制劑大部分為復配試劑，同時其大規模培養過程中也存在不少問題，如發酵放大過程信息采集困難、制劑有效期不長、產品貨架期短等，這些問題的深入研究對解決蠟樣芽孢桿菌高密度培養瓶頸、降低蠟樣芽孢桿菌生產成本、促進細胞大規模培養領域重大突破具有重要意義。2、本課題組技術優勢（1）團隊以項目為紐帶，建立了蠟樣芽孢桿菌在線監控的高密度培養與多階段發酵集成技術，在1000L發酵罐上蠟樣芽孢桿菌活菌數高達800億個/g, 比初始培養提高了230%，達國際領先水平；（2）篩選的芽孢保護劑，可提高蠟樣芽孢桿菌活性，延長半衰期40％以上；（3）協同江蘇省農科院及南京農業技術推廣站進行綠色防控技術推廣，于江蘇浦口林大蔬菜基地、江寧區湖熟街道設施蔬菜基地、溧水傅家邊茶廠等地建立2800畝示范區，重點試驗核心區460畝。推廣示范區內，蠟樣芽孢桿菌對水稻紋枯病、灰霉病、晚疫病等真菌病害抑制率達51.8％～85.9％，與蘇云金芽孢桿菌（Bt）進行增效試驗，小菜蛾殺滅率提高29%，降低化學農藥使用量50％以上，農藥殘留量低于國家無公害農產品標準；（4）目前已在國內外重要期刊發表學術論文10余篇，出版專著《高效有益微生態制劑開發與利用——蠟樣芽孢桿菌》，申請國家發明專利4項，授權3項，其中3項（ZL200910028025.1、ZL201010579133.0、ZL200910028320.7）在南京新百藥業有限公司成功實現轉化。（二）凝結芽孢桿菌團隊自行篩選獲得一株益生凝結芽胞桿菌NJYHHWG 877005，除具有和乳酸菌及雙歧桿菌同樣的保健功效外，還具有耐酸、耐熱、耐鹽、容易培養和保存的特點。凝結芽孢桿菌為兼性厭氧菌，進入腸道后會消耗游離氧，有利于厭氧微生物乳酸菌和雙歧桿菌的生長，多用于調節腸道內微生態菌群平衡，團隊自主知識產權的凝結芽胞桿菌NJYHHWG 877005對甜瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、西瓜炭疽病菌等有很強的防治效果，可進行新型高效生物農藥的開發。

低聚糖、多糖具有較低的代謝能（1 kcal/g），在食品加工中可作為填充劑 部分替代脂肪、蔗糖或淀粉，提高產品的感官特性、儲藏性能及調節機體能量代 謝等功能特性，是一類具有促進腸道健康功能的益生元，可以調節腸道氧化應激， 促進益生菌增殖，提高體液免疫和細胞免疫功能，改善機體血脂代謝。 目前，聚糖的制備主要依賴于天然資源的提取、水解和衍生。天然資源的生5 長周期性和提取工藝的復雜性嚴重制約了聚糖產業的發展。 微波技術在有機合成中已多有應用，我們研究發現微波輔助雜多酸催化技術 可用于制備低聚糖、巨寡糖，采用該技術在特定微波和物料條件下，10 分鐘內快 速合成了高得率（90%以上）的低聚葡萄糖、低聚甘露糖、低聚木糖、葡-半乳聚 糖、類蟲草多糖等產品。比較分析目前食品加工中使用的聚糖化學結構、營養功 能，發現微波固相合成聚糖具有一致的化學和生物學性能。

本項目組從 80 年代末期開始，利用微生物和生態學理論和技術從西部傳統 發酵乳制品中分離篩選具有潛在益生功能的乳酸菌，建立了一個擁有自主產權的2300 多株菌種資源庫；研究和建立了不同功能性益生菌的高效篩選模型，篩選出近 20 株具有特定功能的優良益生菌，并對其進行了系統全面的功能評價；從 細胞、基因組、蛋白質組水平對益生菌的生理、遺傳和發酵特性進行考察，深入了解益生菌的作用機制；針對益生菌在乳制品中應用的關鍵問題，研究和開發了益生菌高密度培養、制備、活性保持、混菌發酵和無菌后添加等關鍵技術； 創新要點 已獲得具有益生功能菌株 20 株，其中已經取得授權專利菌種 5 株，在申請國內專利菌種 6 株，在申請國際授權發明專利 2 株，此外還有 10 項中國授權發明專利。 

本發明公開了一種植物內生菌，分類命名為巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)，完整命名為巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)SAN1，該菌株已于2013年3月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏編號為CGMCC?No.7295。本發明還公開了所述的植物內生菌在修復設施土壤次生鹽漬化與鎘復合污染中的應用。本發明提供的巨大芽孢桿菌CGMCC7295能夠促進植物的生長，改善土壤理化性狀，同時促進植物對Cd的吸收，有效的消除土壤中的Cd污染；并且能高效轉化土壤的硝態氮，減輕次生鹽漬化的危害；通過巨大芽孢桿菌CGMCC7295與植物的聯合作用，可實現設施土壤次生鹽漬化與重金屬Cd復合污染的修復。

  植物內生菌（endophyte）是指能定殖在健康植物組織內，并與植物建立了和諧聯合關系的一類微生物。植物內生菌的研究已逐步成為生命科學領域一個新的研究熱點，受到國內外植物學家和微生物學家的關注。研究已經證實，內生菌在植物體內不僅積極地生存著，而且還能產生多種生物學作用，如固氮、促進植物生長和對病蟲害的防治等作用。人們注意到植物-內生菌這種和諧共生，互利共棲的生命形式，可能是未來生態型農業發展的一條重要思路。所以，在“資源節約型，環境友好型”產業已逐漸成為國內外公認主流發展方向的今天，開展植物內生菌的研究不僅對植物微生物學科的研究對農業可持續發展也有重要的實踐意義。選擇有研究和應用價值的模式植物和內生菌種是進行內生菌研究的先決條件，從農村地區一些重要作物（包括主要蔬菜）中分離多種內生菌是本項研究的首要工作。隨著這些大量植物內生菌資源的分離，植物內生菌研究就可以進一步深入。本人目前已得到一批有重要植物促生作用的細菌及其培養技術，可以轉化為工業化生產。

一、成果簡介 微生物飼料添加劑(FeedGradeMicrobialAdditives)是藥物保健促生長飼料添加劑的最可行替代方案之一。美國FDA定義為可直接飼喂微生物(DFMS)，又被稱為益生素(Probiotics)、益生菌等。它的核心含義是指攝入動物體內參與腸道內微生物平衡的、具有抑制動物胃腸道有害微生物群落的作用，或增強非特異或特異性免疫功能，具有預防疾病、促進動物生長和提高飼料轉化效率的活性微生物制劑。并可以進一步與其他輔料(如生物活性多肽

鹽脅迫直接影響植物的生長，我國現有約9913萬公頃的鹽堿土地，占全國可用耕地面積近四分之一，無法進行大規模農作物種植。植物耐鹽堿促生菌可以通過調節土壤pH值，促進植物對營養物質的吸收，調節植物激素，調節植物耐受氧化和滲透脅迫的能力等，幫助植物抵抗鹽堿脅迫在逆境下生長增產。 對于耐鹽堿促生菌Bacillus subtilis N51和Bacillus cereus T146，實驗室現通過連續發酵，優化發酵工藝以及噴霧干燥工藝，制備孢子形成率達70%以上、干粉菌劑活菌數目達1010/g的菌劑。 對于菌株Kocuria sp. LA1T6、Bacillus sp. LA1T8和Pseudomonas sp.T44，實驗室現進行多糖包衣制劑的開發，研制高穩定性、成膜性、安全性和緩釋性的包衣制劑。