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一種基因工程紅球菌及其構建方法與應用

1. 痛點問題紅球菌是具有高抗逆性（耐有機溶劑、耐高溫、耐酸堿）的特殊放線菌，日本30年前首先使用紅球菌高效催化丙烯腈水合生產(chǎn)丙烯酰胺——其聚合產(chǎn)物廣泛用于石油開采、水處理、土壤改良劑等領域——迄今為止仍是工業(yè)生物技術領域最成功的案例之一。開發(fā)紅球菌基因編輯方法，一方面可以實現(xiàn)紅球菌細胞自身性能的按需調控（如敲除副產(chǎn)物基因），解決丙烯酰胺、丙烯酸銨等酰胺、羧酸類大宗/精細化學品生產(chǎn)中的高成本和高排放問題，另一方面有望以紅球菌細胞為普適性宿主，高表達各種外源功能酶，從而實現(xiàn)重組紅球菌全細胞催化技術的普遍應用，尤其是解決手性醫(yī)藥中間體現(xiàn)有制備工藝中路線長、工藝復雜、原子經(jīng)濟性差、環(huán)境污染嚴重等各種主要問題。但是，作為一種革蘭氏陽性放線菌，紅色紅球菌存在基因組中GC含量高、基因轉化率低、非法重組嚴重等問題，基因組改造困難。目前紅色紅球菌基因組改造主要依賴于自殺質粒介導的同源重組，但自殺質粒轉化效率和單交換成功率很低，正確編輯率更低。因此，迫切需要開發(fā)高效的紅球菌基因組編輯工具。 2. 解決方案本技術核心成果是一種基于CRISPR（成簇規(guī)律間隔短回文序列）-Cas9（DNA剪切蛋白）技術的紅色紅球菌基因組高效編輯方法。該技術通過紅色紅球菌特有啟動子及質粒元件，首先實現(xiàn)了Cas9蛋白在紅色紅球菌中的表達及切割功能；其次成功規(guī)避了紅球菌的限制修飾系統(tǒng)，將紅色紅球菌基因轉化效率提高了80多倍；接下來，又通過紅球菌重組酶的引入，顯著提高了外源基因在紅色紅球菌中的同源重組效率，最終率先成功建立紅色紅球菌的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，不僅可以實現(xiàn)基因組上目標基因的敲除、替換和改造，也可實現(xiàn)多個基因的同時敲除以及無痕疊加敲除，為紅球菌全細胞催化平臺技術開發(fā)及其在化學品綠色先進制造中的應用奠定了堅實基礎。合作需求開展合作開發(fā)、技術許可等，尋求有志于生物制藥、生物合成、石油開采、日化洗滌等不同應用領域進行紅球菌全細胞催化法生產(chǎn)目標產(chǎn)品的企業(yè)合作，尤其是在上述不同領域具有生產(chǎn)和銷售優(yōu)勢或經(jīng)驗的企業(yè)。

清華大學 2021-12-16

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