本發明屬于生物醫藥技術領域，具體的是涉及一種miR?503簇海綿在制備用于治療2型糖尿病藥物中的應用。
2型糖尿病的病因多樣，除遺傳因素如家族遺傳外，肥胖、運動缺乏和自然年齡增長被認為是導致糖尿病發生的主要因素。在這些病理因素下，局部組織或全身范圍內形成慢性低度炎癥，導致內源性胰島素含量的降低即β細胞功能障礙，以及胰島素作用減弱即胰島素抵抗的發生。胰島素抵抗和β細胞功能障礙共同發揮作用，使患者體內糖脂代謝紊亂并出現多種并發癥，是2型糖尿病的典型特征。2型糖尿病的治療手段包括降糖藥物治療和代謝手術治療兩種方式，減重手術雖然效果顯著，但由于創傷較大而僅在極度肥胖的患者中展開，因此藥物治療是2型糖尿病治療的主要手段。目前有多種藥物能分別針對胰島素抵抗和β細胞功能障礙進行治療，能夠改善胰島素抵抗的藥物包括二甲雙胍、噻唑烷二酮類等，促進胰島素分泌的藥物包括GLP?1受體激動劑、DPP?4抑制劑；此外，還有抑制葡萄糖吸收的α?葡萄糖苷酶抑制劑，促進葡萄糖排出的鈉?葡萄糖協同轉運蛋白2抑制劑，以及胰島素等。胰島素抵抗和β細胞功能障礙往往同時存在于患者體內，在進行治療時，通常需要多種藥物長期聯合使用，這不僅影響患者的生活質量，還能造成低血糖、肥胖或過度消瘦等不良反應。因此，研究并提供一種能夠同時改善胰島素抵抗和β細胞功能障礙的新治療方法至關重要。
MiRNA是一類進化上高度保守的單鏈非編碼RNA，長約22?23堿基，在人類中已發現的miRNA有近2500多種。MiRNA經典的作用方式是與其靶基因mRNA的3’?非翻譯區(3’?UTR)結合，抑制其翻譯或促進降解，是基因轉錄后負性調控的主要執行分子，參與細胞增殖、分化、功能維持等過程。近年來的研究發現，miRNA不僅在胞漿內發揮作用，還能被分泌至細胞外承擔細胞間信號交流的功能，其靶基因及作用方式的多樣性決定功能的多樣性。MiR?503簇位于X染色體長臂26 .3位點，包括miR?503和miR?424(小鼠稱miR?322) ，它們具有相同的種質序列(CGACGA)。研究發現胚胎期胰腺中miR?503高表達與胰腺發育相關，而出生后胰腺及胰島中逐漸降低。在成年個體中miR?503簇僅在肺中高表達，而miR?503簇在病理條件下重新開放表達能夠促進多種疾病的發生，如糖尿病壞疽等。MiRNA海綿(miRNA sponge)是麻省理工大學的Phillip Sharp及其同事開發的一種長期抑制miRNA基因的高效方法。MiRNA海綿是一條mRNA，其3’?非翻譯區(3’?UTR)包含若干個miRNA靶定位點。更重要的是，這些靶定位點在RISC切割位點有一些錯配。這樣抑制劑mRNA就不會被降解，而與RISC穩定結合，讓它遠離天然的mRNA靶點。
本發明提供一種miR?503簇海綿，其為miR?503簇的抑制劑，靶向結合內源性miR?503和miR?424(小鼠稱miR?322)從而抑制其功能。該miR?503簇海綿封閉胰島β細胞中miR?503簇的表達，進一步將其應用于制備用于治療2型糖尿病的藥物中的應用，以解決2型糖尿病當前治療方法匱乏以及治療成本高昂的問題。
具體地，所述miR?503簇海綿的核苷酸序列如SEQ ID No .1所示，
進一步地，本發明揭示胰島β細胞內表達增加的miR?503簇能夠損傷β細胞功能，也能促進胰島素抵抗的發生，發現所述miR?503簇海綿可以改善老年性糖尿病小鼠糖耐量受損的表型。
具體在應用時，所述miR?503簇海綿與表達載體有效連接。所述“有效連接”是指本發明的miR?503簇海綿與表達載體的連接使所產生的核酸構建體能在細胞或動物體內轉錄本發明的miR?503簇海綿。
優選地，所述表達載體為8型腺相關病毒載體，優選地，選用胰島素基因啟動子啟動序列表達。在一個具體的實施方式中，采用pAAV?MCS載體。
MiR?503簇核酸構建體可以通過在miR?503簇海綿序列的兩端加上與表達載體相配的酶切位點，合成正向序列和反向序列，以與該表達載體有效連接。
本發明選擇具有明顯糖耐量受損的老年小鼠 ，通過尾靜脈分別注射M ouse insulin1(MIP1)?GFP或MIP1?mmu?miR?503?424?Sponge病毒載體，觀察老年小鼠代謝表型的改變，提供治療2型糖尿病的新方法。
有益效果：本發明發現敲除miR?503簇，能夠有效緩解高脂喂養造成的胰島葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)功能損傷，及外周組抵抗。同時，本發明根據miR?503簇在β細胞和外周組織中的作用原理，對老年糖尿病小鼠治療4周后發現，治療組小鼠糖耐量改善，β細胞GSIS功能改善，治療7周后外周組織胰島素敏感性略有恢復。