2018年，全球首款siRNA藥物Patisiran（Onpattro®）獲得FDA批準(zhǔn)上市。這一事件標(biāo)志著人類在siRNA應(yīng)用于疾病干預(yù)的領(lǐng)域取得了里程碑式的突破。截至目前，已有6款siRNA藥物獲FDA批準(zhǔn)上市，適應(yīng)癥多為罕見病和遺傳病。小核酸藥物已成為繼小分子類藥物和抗體藥物后的第三波全球生物藥研發(fā)浪潮的核心，其應(yīng)用前景不可估量。

siRNA藥物雖然屬于新藥類別，但其發(fā)揮功能所依賴的RNA干擾機(jī)制早已是生命科學(xué)的重要研究領(lǐng)域之一。RNA干擾機(jī)制最早于1998年由Andrew Fire和Criag Mello在秀麗隱桿線蟲中揭示，隨后僅經(jīng)過了8年時(shí)間便成為“諾獎(jiǎng)成果”。盡管siRNA的應(yīng)用前景廣闊，其分子作用機(jī)制仍有許多未解之謎，這也激發(fā)全球科學(xué)家在該領(lǐng)域不斷耕耘。

北京時(shí)間2025年4月16日，西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院申恩志團(tuán)隊(duì)聯(lián)合吳建平團(tuán)隊(duì)在Cell Research雜志上在線發(fā)表了題為“Mechanistic Insights into RNA Cleavage by Human Argonaute2-siRNA Complex”的研究成果。

該文章首次揭示了人源AGO2（hAGO2）-siRNA復(fù)合物切割靶標(biāo)RNA的獨(dú)特分子機(jī)制，表明AGO-siRNA復(fù)合物需要經(jīng)歷精確且嚴(yán)格調(diào)控的構(gòu)象改變，來(lái)介導(dǎo)高效的基因沉默。

文章鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41422-025-01114-7

文章截圖：

兩把“RNA剪刀”各司其職

非編碼小RNA包括miRNA、siRNA和piRNA。它們與Argonaute蛋白結(jié)合形成小RNA依賴的沉默復(fù)合物，介導(dǎo)基因沉默。在這個(gè)過程中，非編碼小RNA擔(dān)任“指揮官”角色，引導(dǎo)Argonaute蛋白到達(dá)目標(biāo)地點(diǎn)（靶標(biāo)RNA）。而Argonaute蛋白則作為“執(zhí)行者”，利用其核酸內(nèi)切酶活性，發(fā)揮“剪刀”功能，將目標(biāo)切斷。“剪刀“切割是Argonaute蛋白最保守的抑制基因表達(dá)的方式。

非編碼小RNA包括miRNA、siRNA和piRNA。它們與Argonaute蛋白結(jié)合形成小RNA依賴的沉默復(fù)合物，介導(dǎo)基因沉默。在這個(gè)過程中，非編碼小RNA擔(dān)任“指揮官”角色，引導(dǎo)Argonaute蛋白到達(dá)目標(biāo)地點(diǎn)（靶標(biāo)RNA）。而Argonaute蛋白則作為“執(zhí)行者”，利用其核酸內(nèi)切酶活性，發(fā)揮“剪刀”功能，將目標(biāo)切斷。“剪刀“切割是Argonaute蛋白最保守的抑制基因表達(dá)的方式。

第二把“剪刀”仍戴神秘面紗

申恩志研究員一直以來(lái)對(duì)有關(guān)兩把“剪刀”的科學(xué)問題都備感興趣，自2019年在西湖大學(xué)建立獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室后，長(zhǎng)期致力于非編碼小RNA的生物學(xué)功能和分子機(jī)制的研究。申恩志團(tuán)隊(duì)此前的研究成果揭示了PIWI“剪刀”切割靶標(biāo)RNA的機(jī)制，那么另一把“剪刀”AGO是如何依賴siRNA在哺乳動(dòng)物體內(nèi)完成靶標(biāo)切割的全過程呢？

在過去的十幾年里，眾多科學(xué)家雖然一直致力于解決的這個(gè)問題，但并未獲得明確答案。siRNA具有重要的生物學(xué)功能，且廣泛應(yīng)用于工具開發(fā)和疾病治療，但其背后的分子機(jī)制仍然未知，可想而知，解決該問題的意義將十分重大。

揭開面紗，如此切割

申恩志團(tuán)隊(duì)聯(lián)合吳建平團(tuán)隊(duì)給這個(gè)懸而未決的問題一個(gè)答案。研究人員借助冷凍電鏡技術(shù)捕捉到hAGO2-siRNA結(jié)合不同長(zhǎng)度的靶標(biāo)RNA的三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，解析了hAGO2-siRNA在切割過程中的構(gòu)象變化。這一研究過程并不容易，AGO-siRNA復(fù)合物內(nèi)部狹窄的通道使其在結(jié)合連續(xù)匹配的靶標(biāo)RNA時(shí)構(gòu)象變得非常不穩(wěn)定，難以被捕捉到。這也是之前研究人員們一直沒有解決該問題的原因。申恩志研究員表示：我們要做的就是攻堅(jiān)克難！最終，他們成功揭示了第二把剪刀如何克服結(jié)構(gòu)限制以實(shí)現(xiàn)高效的靶標(biāo)切割。

AGO-siRNA切割靶標(biāo)的全過程，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是，siRNA種子區(qū)域與靶RNA的初始互補(bǔ)配對(duì)促使hAGO2的L2-PAZ結(jié)構(gòu)域向外位移。隨著堿基配對(duì)延伸到siRNA的中間區(qū)域，PAZ結(jié)構(gòu)域的進(jìn)一步打開觸發(fā)了PIWI-L1-N結(jié)構(gòu)域向核酸結(jié)合通道的重新定位，確保siRNA-靶標(biāo)RNA雙鏈的捕獲。隨后，PIWI-L1-N結(jié)構(gòu)域向下移動(dòng)以容納中間區(qū)域的堿基互補(bǔ)配對(duì)，并激活催化功能。當(dāng)堿基配對(duì)繼續(xù)向siRNA的3’端延伸時(shí)，PAZ-L2-N結(jié)構(gòu)域的不穩(wěn)定性增加，甚至變成無(wú)序狀態(tài)，hAGO2呈現(xiàn)“單葉狀”結(jié)構(gòu)（圖1）。在開放的“單葉”結(jié)構(gòu)中，hAGO2 PIWI結(jié)構(gòu)域上的五個(gè)環(huán)通過與RNA雙鏈的相互作用，保證切割構(gòu)象的穩(wěn)定，以實(shí)現(xiàn)AGO蛋白有效的靶標(biāo)切割。

圖1 hAGO-siRNA結(jié)合靶標(biāo)RNA的構(gòu)象變化

與PIWI蛋白相比，AGO蛋白采用不同的策略激活切割活性。PIWI蛋白寬闊的通道允許piRNA種子區(qū)域以外更廣泛的堿基配對(duì)，但最后需要轉(zhuǎn)變?yōu)?ldquo;鎖定”狀態(tài)才能固定piRNA-靶標(biāo)。而AGO蛋白狹窄的通道限制siRNA-靶標(biāo)RNA雙鏈的延伸，需要大幅度打開構(gòu)象才能容納siRNA中間區(qū)域的堿基配對(duì)。

在構(gòu)象打開的過程中，AGO蛋白上了雙重保險(xiǎn)，第一，N-L1-PIWI結(jié)構(gòu)域的上下位移，保證siRNA-靶標(biāo)RNA雙鏈進(jìn)入活性通道；第二，在開放的“單葉狀”構(gòu)象，AGO與siRNA-靶標(biāo)RNA雙鏈中央?yún)^(qū)域的相互作用將靶標(biāo)RNA固定在催化位點(diǎn)內(nèi)。另外，AGO開放的“單葉”構(gòu)象有助于切割產(chǎn)物快速地解離，使hAGO2無(wú)需輔助因子（RNA解旋酶或ATP）的幫助，可以高效地多循環(huán)切割靶標(biāo)。

圖2 N-PAZ相互作用對(duì)靶標(biāo)切割的重要性

圖3 PIWI loop介導(dǎo)的相互作用對(duì)靶標(biāo)切割的重要性

基于以上發(fā)現(xiàn)，研究團(tuán)隊(duì)闡明了siRNA依賴AGO蛋白執(zhí)行靶標(biāo)RNA切割的逐步機(jī)制，并提供了兩個(gè)“剪刀”AGO和PIWI蛋白在實(shí)現(xiàn)此類切割中的模式差異的見解。這項(xiàng)研究不僅填補(bǔ)了RNA干擾機(jī)制研究中的重要空白，還幫助更全面地理解AGO-siRNA介導(dǎo)的切割在不同生物學(xué)過程中的作用。另外，該研究為開發(fā)新的RNAi工具和藥物提供了新的思路，有望在基因治療和疾病診斷中發(fā)揮重要作用。

近日，國(guó)外科研團(tuán)隊(duì)搶先報(bào)道了hAGO2的切割構(gòu)象，但仍不能解決AGO蛋白如何突破結(jié)構(gòu)限制最終達(dá)到切割構(gòu)象這一核心問題。申恩志研究員表示：“我們的研究解析了AGO-siRNA逐步實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)RNA切割的分子機(jī)制，完整刻畫出AGO-siRNA介導(dǎo)RNA切割的全過程，這是更令人振奮的成果。我們期待更多的科學(xué)家在這個(gè)領(lǐng)域取得更多突破，為人類健康和福祉做出更大的貢獻(xiàn)。”

該工作主要由西湖大學(xué)博士生李珍珍、博士生許祺奎、科研助理張艷等成員共同完成。西湖大學(xué)特聘研究員申恩志、吳建平是本研究論文的共同通訊作者。

申恩志課題組致力于使用不同的實(shí)驗(yàn)手段（分子生物學(xué)、生物化學(xué)、分析化學(xué)、生物信息學(xué)和遺傳學(xué)等），來(lái)研究非編碼RNA的分子機(jī)制和生理功能以及在重大疾病發(fā)生中的作用。