細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位，其內(nèi)部包含眾多細(xì)胞器，這些細(xì)胞器相互協(xié)作，共同維持細(xì)胞的正常功能。然而，由于細(xì)胞器的尺寸微小、動(dòng)態(tài)變化迅速且種類繁多，對(duì)活細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的實(shí)時(shí)成像一直是科學(xué)界面臨的難題。熒光染色是研究細(xì)胞器的重要工具，并多次獲得諾貝爾獎(jiǎng)。然而，傳統(tǒng)的特異性熒光標(biāo)記技術(shù)雖然能夠?qū)?—4種細(xì)胞器進(jìn)行成像，但隨著標(biāo)記數(shù)目的增加，就容易出現(xiàn)光譜串?dāng)_和標(biāo)記不上的問(wèn)題，嚴(yán)重阻礙了多細(xì)胞器互作的研究進(jìn)程。

近日，一項(xiàng)發(fā)表于《自然·通訊》的研究成果，為活細(xì)胞內(nèi)多細(xì)胞器的成像難題帶來(lái)了重大突破。北京大學(xué)未來(lái)技術(shù)學(xué)院席鵬團(tuán)隊(duì)聯(lián)合東方理工大學(xué)金大勇團(tuán)隊(duì)利用脂膜探針標(biāo)記所有的有膜細(xì)胞器，再結(jié)合轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡和深度學(xué)習(xí)成功實(shí)現(xiàn)了15種細(xì)胞結(jié)構(gòu)的同時(shí)成像。該方法打破了傳統(tǒng)多色成像的通道數(shù)量上限，為測(cè)繪活細(xì)胞內(nèi)多種亞細(xì)胞器互作圖譜提供有力工具。這一工作以“Fast Segmentation and Multiplexing Imaging of Organelles in Live Cells”為題發(fā)表在Nature Communications上。

論文截圖

為了解決熒光特異性標(biāo)記的難題，研究人員采用了“反其道而行之”的策略，即放棄多細(xì)胞器標(biāo)記的特異性，轉(zhuǎn)而利用一種名為尼羅紅的脂質(zhì)染料對(duì)多種細(xì)胞器的膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行非特異性染色。而在進(jìn)入不同的有膜細(xì)胞器后，染料特有的“環(huán)境變色”能力使其能夠揭示所在的細(xì)胞器種類。由于尼羅紅的發(fā)射光譜對(duì)膜的組分與環(huán)境非常敏感，通過(guò)雙波段同時(shí)雙色成像，可以通過(guò)光譜信息區(qū)分形狀和大小相似的細(xì)胞器。結(jié)合轉(zhuǎn)盤共聚焦超分辨顯微鏡的高速、低光毒性成像能力，研究人員能夠在短時(shí)間內(nèi)獲取大量高時(shí)空分辨率的圖像數(shù)據(jù)。

圖1 通過(guò)尼羅紅脂質(zhì)染料標(biāo)記、超高分辨率成像與深度學(xué)習(xí)算法的深度融合實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)15種細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)解析：線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，脂質(zhì)液滴，細(xì)胞膜，溶酶體，內(nèi)吞體，高爾基體，核膜，過(guò)氧化酶體，細(xì)胞偽足，核內(nèi)陷體，細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)

在此基礎(chǔ)上，研究人員引入了深度學(xué)習(xí)技術(shù)，訓(xùn)練了一組深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（DCNN），能夠從尼羅紅染色的圖像中學(xué)習(xí)并預(yù)測(cè)出15種細(xì)胞器的精確位置和形態(tài)（圖1）。與傳統(tǒng)的圖像分割方法相比，基于深度學(xué)習(xí)的方法不僅速度快、準(zhǔn)確度高，而且具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。通過(guò)對(duì)大量圖像數(shù)據(jù)的訓(xùn)練，DCNN能夠自動(dòng)識(shí)別細(xì)胞器的特征，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞器的快速分割和多路復(fù)用成像。

這一技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)的特異性熒光標(biāo)記、多色成像帶來(lái)了革命性的突破，使得僅使用一種或少數(shù)幾種染料即可實(shí)現(xiàn)多細(xì)胞器的實(shí)時(shí)成像與互作。同時(shí)，由于尼羅紅染料的高效性和深度學(xué)習(xí)算法的高精度，該技術(shù)能夠在減少光毒性的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞器動(dòng)態(tài)變化的長(zhǎng)時(shí)間觀察。這對(duì)研究細(xì)胞器在細(xì)胞周期中的變化（圖2）、細(xì)胞器之間的相互作用以及細(xì)胞在不同生理和病理狀態(tài)下的行為具有重要意義。

此外，該技術(shù)還展示了良好的普適性和擴(kuò)展性。研究人員在多種細(xì)胞系和組織樣本中驗(yàn)證了該技術(shù)的有效性，并成功將其應(yīng)用于果蠅睪丸組織的成像中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)活體組織內(nèi)細(xì)胞器的多路復(fù)用成像。這為未來(lái)在更復(fù)雜的生物樣本中應(yīng)用該技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

圖2 細(xì)胞不同有絲分裂階段的多細(xì)胞器全景成像

傳統(tǒng)熒光成像技術(shù)因“一對(duì)一”特異性標(biāo)記策略的局限性，面臨成像通道有限、光譜串?dāng)_、標(biāo)記效率低等問(wèn)題，難以滿足活細(xì)胞多細(xì)胞器互作研究的需求。本研究提出了一種全新策略：利用通用脂質(zhì)染料（如尼羅紅）標(biāo)記多達(dá)15種膜細(xì)胞器，結(jié)合光譜比率成像提取細(xì)胞器的“光學(xué)指紋”，并通過(guò)深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)高精度分割與多色成像。這一方法突破了傳統(tǒng)熒光成像的技術(shù)瓶頸，顯著提高了成像速度與通量，為活細(xì)胞器互作研究提供了全新工具。

這一成果的出現(xiàn)，標(biāo)志著活細(xì)胞多細(xì)胞器成像技術(shù)邁入了一個(gè)新的階段。它不僅為細(xì)胞生物學(xué)研究提供了新的視角和工具，也為理解細(xì)胞器在健康和疾病中的作用提供了新的可能性。隨著這一技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用，科學(xué)家將有望更深入地探索細(xì)胞的奧秘，為醫(yī)學(xué)研究和疾病治療帶來(lái)新的希望。

諾獎(jiǎng)得主Eric Betzig教授在最近發(fā)表于Nature Methods的評(píng)述文章“A Cell Observatory to reveal the subcellular foundations of life”中，對(duì)這一工作進(jìn)行了高度評(píng)價(jià)：“從寥寥幾個(gè)光譜不同的標(biāo)記物中分類和量化數(shù)十種膜結(jié)構(gòu)的性質(zhì)，從而解決了活細(xì)胞熒光顯微鏡的主要局限之一。”（圖3）

圖3 結(jié)合深度學(xué)習(xí)方法進(jìn)一步區(qū)分出非特異性標(biāo)記的不同細(xì)胞器結(jié)構(gòu)。諾獎(jiǎng)得主Eric Betzig在Nature Methods中對(duì)這一工作進(jìn)行了高度評(píng)價(jià)