俗話說“要想活到老，飯吃七分飽”，而這里的“七分飽”，說的便是受到衰老研究領(lǐng)域廣泛認(rèn)可的一種延長壽命、延緩衰老的方法——卡路里限制（calorie restriction, CR）：它是指在不造成營養(yǎng)缺乏的基礎(chǔ)上，將食物的攝入量減少到原先的70%左右的飲食方式。卡路里限制的強大之處在于它是目前為止唯一一種在所有被研究過的實驗動物——包括酵母、線蟲、果蠅、小鼠和靈長類中，都能觀察到抗衰老的益處的方法。近年來，在人群的回溯性與實驗性研究中，也觀察到了卡路里限制能改善衰老相關(guān)的肥胖、胰島素抵抗、肌肉退化、血脂異常和癌癥等并發(fā)癥，并且不影響受試者的生活質(zhì)量。

然而，盡管卡路里限制有如此廣泛的益處，長期的飲食控制在人群中卻是難以推廣的，尤其是在真正需要延緩衰老的老年人群中，限制飲食還可能造成他們的營養(yǎng)不良和肌肉萎縮。因此，探究卡路里限制抗衰老的“好的一面”，也就是它延緩衰老的具體機制，并在此基礎(chǔ)上模擬卡路里限制，最終讓人們不用控制飲食，便能達到延年益壽的效果，就是我們追求的目標(biāo)。目前，已有大量能夠模擬卡路里限制的藥物——如二甲雙胍、白藜蘆醇和雷帕霉素等，他們的共同特征都是靶向卡路里限制下游的關(guān)鍵作用蛋白以及通路，達到延壽的目的。然而，機體在真實的卡路里限制中發(fā)生了什么改變，這些改變產(chǎn)生了什么信號，又如何傳導(dǎo)到上述通路并發(fā)揮抗衰老的作用，尚未得到完整的解釋，這給我們進一步設(shè)計相關(guān)的干預(yù)策略帶來了不小的困難。

廈門大學(xué)林圣彩院士團隊從卡路里限制小鼠的血清出發(fā)，經(jīng)過代謝組學(xué)鑒定和隨后的逐個排查，最終找到了卡路里限制的模擬物：石膽酸（LCA），并在線蟲、果蠅和小鼠中分別驗證了石膽酸延緩衰老，延長壽命的作用。在此基礎(chǔ)上，他們又進一步探索，最終找到了石膽酸的分子靶點——TULP3，并發(fā)現(xiàn)了TULP3能夠通過激活sirtuin-v-ATPase信號軸，激活在卡路里限制中起到延緩衰老關(guān)鍵作用的AMPK（AMP-activated protein kinase）蛋白，從而延緩衰老。相關(guān)工作分別以“Lithocholic acid phenocopies anti-ageing effects of calorie restriction”和“Lithocholic acid binds TULP3 to activate sirturins and AMPK to slow down ageing”為題，以兩篇Article的篇幅，發(fā)表在Nature期刊上。

研究者們首先確定了經(jīng)過四個月的卡路里限制的小鼠，其體內(nèi)的AMPK被充分激活（圖1，下，以肌肉為例），這與AMPK在卡路里限制時起到的關(guān)鍵作用相符。然而，研究者們進一步發(fā)現(xiàn)在此時，小鼠卻并沒有發(fā)生“低血糖”，也就是血糖并未下降到先前他們發(fā)現(xiàn)的、足以激活A(yù)MPK的程度（5 mM以下）：與正常飲食的小鼠在饑餓8小時血糖就降低到4 mM（圖1，左上）相比，卡路里限制小鼠的血糖至少在5.5 mM（圖1，右上），這說明卡路里限制所導(dǎo)致的AMPK激活并不因為降低葡萄糖所引起。研究者們于是嘗試將卡路里限制小鼠的血清添加到細(xì)胞培養(yǎng)液中，的確發(fā)現(xiàn)即使在高糖（25 mM）的DMEM中，AMPK仍舊能被激活（圖2），這說明卡路里限制對AMPK激活的信號存在于血清中。研究者們進一步發(fā)現(xiàn)血清透析，去除其中的小分子代謝物，抑制了其對AMPK的激活；而熱滅活血清，去除其中的蛋白則無此作用，這說明了卡路里限制后的血清通過其中的小分子激活了AMPK。

圖1.卡路里限制與饑餓對小鼠血糖和肌肉AMPK激活的效果對比

圖2.卡路里限制后的小鼠血清可以激活高糖培養(yǎng)的細(xì)胞中的AMPK

研究者們于是進一步利用多種質(zhì)譜方法（包括液相色譜-質(zhì)譜，氣相色譜-質(zhì)譜和毛細(xì)管電泳質(zhì)譜聯(lián)用等），尋找卡路里限制后血清中發(fā)生顯著變化的小分子代謝物。發(fā)現(xiàn)在他們能測得的代謝物中，卡路里限制影響了超過一半的代謝物水平（695個，包括341個極性代謝物和354個脂類），這也和傳統(tǒng)的“飲食決定代謝”的觀點吻合。研究者于是繼續(xù)探究是哪些化合物影響了AMPK的激活。他們首先去除了血清中的脂質(zhì)，發(fā)現(xiàn)仍能引起AMPK的激活，于是他們就把重點放在剩下的341個極性代謝物中。在這些代謝物中，有212個水平升高和129個降低：對于升高的代謝物，他們將其直接添加至細(xì)胞培養(yǎng)基中，觀察其是否能夠直接激活A(yù)MPK；而對于含量降低的代謝物，他們則假設(shè)這些代謝物起到了抑制AMPK的作用（在卡路里限制后，這種抑制作用就被解除）——于是將其添加到了已被卡路里限制的血清激活了AMPK的細(xì)胞的培養(yǎng)基中，觀察其是否能夠反過來抑制AMPK的激活。他們也設(shè)計了實驗所用的代謝物的濃度：對于已報道了生理濃度的，直接結(jié)合卡路里限制后的變化進行選擇；未報道生理濃度的，則統(tǒng)一選擇10 mM作為最高濃度，以此為基準(zhǔn)進行下調(diào)，就此設(shè)定濃度梯度。經(jīng)過逐個篩選，他們鑒定出了6個代謝物能夠激活A(yù)MPK，而這其中，只有石膽酸能夠在符合卡路里限制后的濃度下（血清中穩(wěn)定在1 μM左右，且不隨著進食等條件發(fā)生變化；圖3，左），激活A(yù)MPK（圖3，右），而直接對小鼠以及線蟲、果蠅等其它模式動物喂食石膽酸后，也能觀察到其體內(nèi)的AMPK被激活。

圖3.卡路里限制小鼠血清中石膽酸含量（左）以及該濃度下石膽酸對AMPK的激活（右）

研究者們于是進一步在線蟲、果蠅和小鼠中驗證石膽酸是否能模擬卡路里限制的抗衰和延壽效果。通過喂食石膽酸，他們發(fā)現(xiàn)線蟲和果蠅的壽命顯著增加，而且抗氧化應(yīng)激能力和極端環(huán)境下的生存能力（抗逆性）也得到顯著的提升（圖4）。對于老年小鼠，發(fā)現(xiàn)石膽酸喂食一個月后，可以提升其抓握力和跑步能力（圖5），同時其肌肉的損傷修復(fù)能力也明顯提升，這表明石膽酸有促進小鼠肌肉的年輕化的作用。進一步地，在AMPK敲除或敲低的線蟲和果蠅（分別為aak-2的線蟲和Act5C-GAL4-AMPKαRNAi的果蠅；圖4），以及AMPK肌肉特異性敲除的老年小鼠（圖5；α-MKO）中，就觀察不到石膽酸的上述作用，這說明石膽酸是通過激活A(yù)MPK，模擬了卡路里限制的有益作用。有意思的是，作為一種次級膽酸，石膽酸是由肝臟合成的初級膽酸分泌到腸道后，由腸道微生物轉(zhuǎn)化而來；而至少目前，這樣的轉(zhuǎn)化機制在線蟲和果蠅體中還未被發(fā)現(xiàn)。然而即便如此，石膽酸仍能在線蟲和果蠅中激活A(yù)MPK并延壽，這說明上述動物中有一條保守的AMPK激活通路，維持了健康長壽的有益效果。

圖4石膽酸通過AMPK延長線蟲（a）和果蠅（b）的壽命

圖5.石膽酸通過AMPK增加老年小鼠的握力（上）和跑步能力（下）

研究者們于是進一步探索石膽酸通過何種通路激活A(yù)MPK。他們觀察到石膽酸，乃至卡路里限制對于AMPK的激活都不會引起AMP水平的上升，也不會引起細(xì)胞鈣離子水平的增加，排除了傳統(tǒng)的AMP或者鈣離子依賴的激活途徑。研究者們于是探究了先前他們鑒定出的葡萄糖感知途徑即溶酶體途徑，的確發(fā)現(xiàn)石膽酸是通過該途徑激活A(yù)MPK的：敲除了溶酶體途徑關(guān)鍵蛋白AXIN和LAMTOR1，石膽酸不再能夠在細(xì)胞中激活A(yù)MPK。而鑒于石膽酸和卡路里限制都沒有降低血糖到能夠啟動溶酶體途徑的程度的能力——也就是他們先前所鑒定的感知葡萄糖的相關(guān)受體和機制都不再適用，研究者們進一步嘗試尋找石膽酸靶向溶酶體途徑的受體和機制。由于石膽酸能夠抑制溶酶體上的質(zhì)子泵v-ATPase復(fù)合體——這是溶酶體途徑活化的關(guān)鍵節(jié)點，研究者們于是探究了石膽酸對v-ATPase的影響。他們發(fā)現(xiàn)，石膽酸顯著影響了v-ATPase的翻譯后修飾，尤其是乙?；揎?mdash;—在添加了去乙酰化酶抑制劑，使得v-ATPase的乙?；療o法被移除（無法去乙?；?，就能夠阻止石膽酸對AMPK的激活。利用蛋白質(zhì)修飾質(zhì)譜，他們進一步得到了構(gòu)成v-ATPase復(fù)合體的全部21個（種）亞基的總共263個乙酰化修飾的位點。通過逐一將這些位點突變成R，從而模擬其去乙?；姆绞?，他們最終發(fā)現(xiàn)，只要同時引入v-ATPase的V1E1亞基的三個位點——K52、K99和K191的突變體（V1E1-3KR），就能夠在沒有石膽酸處理的條件下抑制v-ATPase，并激活A(yù)MPK到和石膽酸處理相當(dāng)?shù)某潭龋▓D6），而在線蟲、果蠅和小鼠肌肉中引入V1E1-3KR突變，也能起到激活A(yù)MPK和延緩衰老的效果。

圖6.細(xì)胞中引入V1E1的突變對AMPK的激活效果

在此基礎(chǔ)上，研究者們進一步探索石膽酸是如何引起V1E1的去乙?；?。已知體內(nèi)去乙?；钢饕怯蓛纱蠹易寮碨IRTs（sirtuins）家族（有SIRT1到SIRT7七個成員）和HDACs家族（HDAC1到HDAC11）組成，而在細(xì)胞中表達任意一個SIRT——尤其是SIRT1，即可以直接激活A(yù)MPK。相比較之下，HDACs家族蛋白的表達則無此現(xiàn)象。需要注意的是，SIRTs家族的蛋白之間有較強的redundancy，例如敲除SIRT1，其功能會被其它SIRTs所彌補，因此在細(xì)胞中敲除單個SIRT，并不能完全阻斷石膽酸對AMPK的激活。研究者們于是將7個SIRT家族蛋白全部敲除，終于檢測到了對石膽酸所引起的V1E1的去乙?；约皩MPK的激活的完全阻斷。作為對照，研究者們還檢測了石膽酸對另一個SIRTs（SIRT1、SIRT2和SIRT6）的經(jīng)典底物——組蛋白H3的K9位點的乙?；?12-14)，結(jié)果也表明，石膽酸促進了H3-K9的去乙酰化。因此，石膽酸是通過促進SIRTs的活力，使其去乙?；疺1E1并抑制v-ATPase的活力，從而啟動溶酶體途徑并激活A(yù)MPK。

然而，當(dāng)研究者們試圖進一步在體外重構(gòu)上述石膽酸促進SIRTs活力的過程時，卻遇到了困難：他們發(fā)現(xiàn)，盡管原核表達的SIRT1的確能夠在體外去乙?；铣傻腣1E1多肽，但石膽酸卻不能促進這一過程（圖7，左）。這和體內(nèi)得到的結(jié)論完全不同，也讓研究者們陷入了困境——難道是上述的篩選過程出錯了嗎？于是，他們把體外系統(tǒng)中的每種成分一步步地“替換”成近似于細(xì)胞內(nèi)的成分，最終發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用從細(xì)胞中純化（免疫沉淀）所得到的SIRT1代替原核表達的SIRT1，或者讓原核表達的SIRT1先和細(xì)胞裂解液孵育，再加進體外系統(tǒng)中，就能夠觀察到石膽酸對SIRT1活力的提升了（圖7，右）！這意味著SIRT1在體內(nèi)天然存在著一個“伙伴”：由它來結(jié)合石膽酸，再反過來導(dǎo)致SIRT1的激活；而原核表達的SIRT1沒有這個“伙伴”的結(jié)合，自然也就不能響應(yīng)石膽酸的調(diào)節(jié)。

圖7.石膽酸對原核表達SIRT1蛋白（左）以及與細(xì)胞裂解液孵育后的、原核表達的SIRT1蛋白（右）的去乙?；盍τ绊?/p>

為了找到這個“伙伴”，研究者們將與細(xì)胞裂解液孵育后的SIRT1進行了蛋白質(zhì)譜鑒定，鑒定到了1655個SIRT1的潛在相互作用蛋白。研究者們構(gòu)建了所有這些蛋白的表達質(zhì)粒，通過逐一在細(xì)胞中和SIRT1共表達再進行免疫共沉淀，鑒定出了157個蛋白與SIRT1有直接的相互作用。進一步，研究者們逐一在細(xì)胞中敲低了這157個蛋白，最終發(fā)現(xiàn)一個名為TULP3的蛋白的敲低幾乎可以完全阻斷石膽酸對于AMPK的激活。研究者們進一步發(fā)現(xiàn)，石膽酸確實可以直接結(jié)合TULP3，而分子對接模擬實驗則顯示出TULP3上有四個位點（Y193, P195, K333和P336），它們通過疏水作用，構(gòu)成了石膽酸的潛在結(jié)合口袋。在TULP3敲除的細(xì)胞系中回補突變了這四個位點的TULP3（TULP3-4G）同樣阻斷了石膽酸對AMPK的激活（圖8）。重要的是，在體外加入原核表達的TULP3，就能夠觀察到石膽酸對SIRT1活力以及對V1E1去乙?；饔玫拇龠M，加入TULP3-4G卻不行，這進一步證實了TULP3是石膽酸激活SIRT1從而啟動溶酶體途徑激活A(yù)MPK的靶點。

圖8. TULP3敲除阻止了石膽酸對AMPK的激活（左），且回補不結(jié)合石膽酸的突變體（TULP3-4G）無法恢復(fù)石膽酸對AMPK的激活（右）

最后，研究者在線蟲，果蠅和小鼠中分別探究了TULP3-sirtuin-v-ATPase軸對衰老和壽命的影響，類似于AMPK的敲除，他們發(fā)現(xiàn)只要將上述物種體內(nèi)的TULP3敲除，或者引入無法結(jié)合石膽酸的TULP3突變體，石膽酸便無法發(fā)揮抗衰效果（圖9；以小鼠肌肉中敲除TULP3再回補TULP3-4G突變體為例）。

圖9.石膽酸對老年小鼠抓握力（上）和跑步能力（下）的提高依賴于TULP3

綜上，林圣彩團隊鑒定了一個卡路里限制的模擬物——石膽酸，并解析了石膽酸通過TULP3-sirtuin-v-ATPase-AMPK軸發(fā)揮延壽效果的具體機制（圖9，右），這一發(fā)現(xiàn)補全了機體感知卡路里限制引起的代謝信號并發(fā)揮延緩衰老作用的空白。石膽酸是否可以作為新的長壽藥物將進行進一步臨床驗證。同時，對于石膽酸延壽機理的解析也為開發(fā)新的長壽藥物提供了新的理論和靶點。

回顧起來，林圣彩院士感嘆，他的團隊從發(fā)現(xiàn)（低）葡萄糖感知通路是延長壽命的核心軸(8-10, 15)，到發(fā)現(xiàn)該通路除了能感知餐前正常的葡萄糖下降，也介導(dǎo)了二甲雙胍的有益功能（圖10，左），再到現(xiàn)在加上了卡路里限制的模擬物也就是石膽酸的“借道”（圖10，右），他越發(fā)覺得AMPK的溶酶體通路是高等生物中的固有的通路，也很可能因為這樣重要的生理功能，而在進化上被保留下來?？梢哉f，這是大自然賜予生命的不僅能抵抗饑餓，還能從饑餓中獲得益處的“賦能”。

圖10.溶酶體通路全景圖

這兩篇文章的第一研究者瞿琦是廈門大學(xué)2014級本科生，于2018年留校攻讀碩士，并在2019年轉(zhuǎn)博至今。據(jù)林圣彩院士介紹，瞿琦是在2016年，通過廈門大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃”進入他的實驗室學(xué)習(xí)的，從那時起，他就參與了這個工作，為石膽酸及其靶點和機制的鑒定付出了八年半的辛勤努力；尤其是在發(fā)現(xiàn)石膽酸并不能直接促進SIRT1的活力，還需要重新尋找其靶點的時候，他沒有氣餒，而是心無旁騖地又付出了三年半的時間，最終完成了整個機制的發(fā)現(xiàn)，也深深地鼓舞了團隊的所有人。兩篇文章的共同第一研究者陳艷和王鈺則分別鑒定出了石膽酸及其通路在果蠅、小鼠和線蟲中的功能，而第二篇文章的共同第一研究者王維澈則承擔(dān)了SIRTs的相互作用蛋白的篩選和鑒定，他們和林圣彩團隊的其它成員一起，都為該工作的研究做出了不可替代的貢獻。此外，大連化物所樸海龍研究員和遺傳與發(fā)育所稅光厚教授指導(dǎo)了本文的代謝物鑒定，北京大學(xué)姜長濤教授和廈門大學(xué)郭浩教授指導(dǎo)、分析了腸道菌群對石膽酸的產(chǎn)生影響，廈門大學(xué)俞勇副教授、北京大學(xué)劉穎教授和廈門大學(xué)劉波教授、鄭燚明教授分別指導(dǎo)了線蟲和果蠅的相關(guān)實驗，廈門大學(xué)鄧賢明教授指導(dǎo)了石膽酸制劑的制作與使用，廈門大學(xué)田華雨教授和陳穎教授指導(dǎo)、協(xié)助了多個敲入細(xì)胞系的構(gòu)建，廈門大學(xué)分析測試中心的多位技術(shù)人員承擔(dān)了本研究的代謝物和蛋白質(zhì)譜鑒定工作，廈門大學(xué)實驗動物中心則提供、構(gòu)建了本研究所用到的小鼠品系。