2025年1月 6日，我所資源與育種中心團隊聯合云南省農業科學院熱帶亞熱帶經濟作物研究所、福建農林大學、山西農業大學等單位，在中科院一區Top學術期刊《Journal of Integrative Plant Biology》(IF=9.3)在線發表題為“Haplotype-resolved genome of a papeda provides insights into the geographical origin and evolution of Citrus”的研究論文，為柑橘物種的起源和進化提供了新的見解。

我國是柑橘重要起源中心和遺傳多樣性中心，資源類型豐富。柑橘種間/內自然雜交頻繁，導致遺傳背景十分復雜，盡管前人對柑橘的起源和進化已有了一定研究，但仍存在爭議。2018年，《Nature》報道，柑橘屬起源于喜馬拉雅山脈的東南麓，包括中國云南西部、印度阿薩姆東部和緬甸北部等地區(Wu et al., 2018)。《Nature Genetics》2023年報道，古印度板塊可能是柑橘亞科的起源中心，來自于中國中南部的宜昌橙(Citrus ichangensis)、莽山野柑(C. mangshanensis)、枳(C. trifoliata 或Poncirus trifoliata )、金柑(C. hindsii或Fortunella hindsii)、寬皮柑橘(C. reticulata)等被認為是早期分化的柑橘，該分布區域可能為柑橘屬的初生起源中心，來自于喜馬拉雅山東南麓(分布有柚(C. grandis或C. maxima)和枸櫞(C. medica))和澳大利亞及其附近島嶼(分布有澳指檬、澳沙檬等)是柑橘屬的兩個次生分化中心(Huang et al., 2023)。枸櫞、柚和寬皮柑橘為柑橘屬的三大原始種(Wu et al., 2018; Huang et al., 2023)，起源于南嶺山脈的莽山野橘(C. reticulata)是最原始的寬皮柑橘類型(Wang et al., 2018)，大翼橙亞屬(Papeda)為柑橘屬的野生類型。不同柑橘種質資源通過種內、種間、屬間的自然雜交及選擇，逐漸形成了枸櫞、柚、寬皮柑橘、莽山野柑、酸橙、甜橙、香橙、檸檬、黎檬、來檬、葡萄柚等類型(Wu et al., 2018；Huang et al., 2023)。然而，不同種之間的演化關系，種內如何進化等問題仍不清晰。

研究團隊從云南省西雙版納傣族自治州景洪市阿旦山的原始森林中發現一株樹齡超200年的大翼葉柑橘，樹體高約12 m，樹干直徑約40 cm，本葉長與翼葉長的比值為1.58；花朵叢生在莖上，花瓣淡紫色，花絲分離，花藥黃色、飽滿，花粉多，部分花雌蕊敗育(圖1)。親緣關系分析發現，西雙版納大翼橙與馬蜂柑、馬來西亞大翼橙具有較近的親緣關系(圖4A)。因此，表型和基因型數據表明，西雙版納大翼橙屬于柑橘屬的大翼橙亞屬(圖2)。溯祖分析發現(圖2C)，以西雙版納大翼橙為代表的大翼橙(Papeda species)分化時間大約為750萬年前，比宜昌橙(Ichang papeda)更早分化出來，是柑橘屬中最原始的類型。

圖1 西雙版納大翼橙的基本形態特征

圖2 代表性柑橘的葉片、果實特征和大翼橙溯祖分析

A.代表性柑橘的葉片；B.代表性柑橘的果實；C.大翼橙溯祖分析

基于Pacbio Sequel II平臺、Hi-C文庫和Illumina HiSeq X Ten平臺測序數據，組裝出294 Mb的染色體級別的西雙版納大翼橙基因組，Benchmarking Universal Single-Copy Ortholog(BUSCO)完整性高于 98%，LTR assembly index(LAI)得分高于 21.1 。發現了5.6 Mbp(1.2%)的變異，包括175萬個SNPs、149471個插入和154215個缺失(圖3)。通過功能基因比較，在單倍型1和單倍型2中分別發現了535個和499個單倍型特異性基因。

圖3 西雙版納大翼橙兩套單倍型基因組比較分析

A. 兩個單倍型基因組之間的結構差異；B.不同組織的等位基因特異性表達基因的韋恩圖；C.單倍型Hap1的chr3和單倍型Hap2的chr6之間發生的易位事件。

基于組裝的西雙版納大翼橙核基因組和葉綠體基因組，對來源于國家柑橘種質資源圃(重慶)和云南收集的涵蓋所有柑橘類型的378份材料(1份外類群重測序來源于NCBI)進行重測序，開展種群結構、系統進化、溯祖、雜種起源、親緣關系鑒定、苦味的選擇性清除等分析。

系統發育樹顯示(圖4B)，除了莽山野柑，柑橘屬分為兩個進化支，一支以宜昌橙、寬皮柑橘、香橙、甜橙等類型為代表，另一支主要包括大翼橙、澳指檬、澳沙檬、枸櫞、紅河大翼橙、柚、酸橙等類型。在柑橘屬兩個進化支中，最原始的大翼橙亞屬在云南南部的原始森林中均有分布，如：分布在云南西雙版納的馬蜂柑、西雙版納大翼橙等大翼橙，分布于云南紅河的元江宜昌橙，這些類型與發現于云南臨滄的柑橘化石C. linczangensis具有較近的地理位置。結合系統發育分析、物種分化時間、地理起源等數據，推測柑橘屬植物從起源中心朝東南亞和中國東部兩個方向進行演化和傳播(圖4C)。第一個方向是通過瀾滄江和紅河等水系向東南亞國家進行傳播，演化形成類型豐富的柚類和大翼橙資源；第二個方向是經過珠江、長江等水系向東進行傳播和演化，形成類型豐富的宜昌橙、柚、寬皮柑橘、酸橙、香橙、甜橙等柑橘種質資源。

圖4 基于4DTv進行系統進化分析

A.378個柑橘材料的全基因組進化樹，Chinese box orange為外類群，聚類樹外圍環上的條形圖分別為汁胞 (藍色) 和囊衣(紅色)的苦味值，比例尺表示苦味值；B.柑橘代表性物種的分化時間樹；C.柑橘屬的進化和傳播路線

我們基于重測序數據對這些材料的遺傳背景進行了分析。發現枸櫞之間存在大量的基因流(圖5)，尼泊爾和印度尼西亞的枸櫞可能通過絲綢之路從四川傳播過去，大翼橙(Papeda species)和四川的枸櫞可能是澳指檬的親本。分布于云南元江原始森林的元江宜昌橙在宜昌橙的進化中扮演重要角色。來源于云南昭通、貴州、湖南等地的宜昌橙與元江宜昌橙具有較近的親緣關系，元江宜昌橙可能是重慶、湖南、廣西等地方宜昌橙的母本，并通過珠江、長江傳播到下游，在重慶、湖南、廣西等地演化成宜昌橙雜種，比如廣西田林的大種橙。同時，柑橘的屬與屬之間也易雜交，序列相似性分析發現，柑橘屬的莽山野柑、元橘與柑橘屬的宜昌橙和金柑屬有較高的序列相似性，金柑屬的融安金柑的基因流流向柑橘屬的莽山野柑和元橘(圖6)，這些發現刷新了對莽山野柑和元橘的認識，它們可能不應被歸為寬皮柑橘類型。作為寬皮柑橘中最原始的莽山野橘，其基因流顯著流向湖南道縣和江西的野生寬皮柑橘(圖6)，野生、半野生和栽培寬皮柑橘之間也存在大量的基因流(圖7)，基因流的流向與水系走向趨于一致，表明寬皮柑橘從南嶺山脈開始，借助長江及其支流，逐漸進化和傳播形成各種類型的寬皮柑橘。這些結果表明，大多數柑橘為自然雜交形成，存在廣泛的基因流。

圖5 不同類型香櫞之間的基因流分析

圖6 金柑、莽山野柑、野生寬皮柑橘之間的基因流分析

圖7 不同寬皮柑橘類型之間的基因流分析

對柑橘汁胞中的苦味程度進行感官評價，較原始和野生的柑橘具有較大的苦味值，比如大翼橙、宜昌橙、紅河大翼橙、枳、酸橙、部分柚等，檸檬、寬皮柑橘、甜橙等基本沒有苦味(圖4A)。選擇性清除分析(XP-CLR)發現，一些參與類檸檬苦素和類黃酮生物合成的4-香豆酸-CoA連接酶、花青素還原酶、糖苷轉移酶等基因在柑橘馴化過程中受到了選擇(圖8)。