近日，中國農業大學生物學院陳三鳳教授課題組在Cell Press細胞出版社旗下的知名學術期刊《生物技術趨勢》（Trends in Biotechnology）在線發表了題為《利用合成生物學方法在水稻中表達固氮酶合成途徑和克服固氮酶在植物細胞質中的不穩定性》（Using synthetic biology to express nitrogenase biosynthesis pathway in rice and to overcome barriers of nitrogenase instability in plant cytosol）研究論文。
該研究通過多基因組裝、單轉化、共轉化及雜交等技術，將來自2個固氮細菌的13個固氮基因（約40 kb）導入水稻中，水稻基因組重測序表明13個固氮基因整合在水稻1號染色體的2個位點，qRT-PCR和Western blot分析表明固氮基因在水稻中能轉錄和表達，而且能形成固氮酶的NifDK四聚體，并發現和解決了NifH蛋白在植物細胞質中被蛋白內切酶切割的問題，為實現禾本科植物實現“自主固氮”提供了重要參考。
固氮細菌利用體內的固氮酶在常溫和常壓下將空氣中的N2 還原成氨的過程稱為生物固氮 (Biological nitrogen fixation)。禾本科植物由于缺乏根瘤共生固氮體系, 其高產和穩產高度依賴化學氮肥。利用合成生物學方法將固氮酶合成途徑直接導入禾本科植物使其實現“自主固氮”, 是有望減少氮肥用量的一個有效途徑。
固氮酶是一種非常復雜的金屬酶，由2種蛋白組份組成：鐵蛋白（也稱為NifH蛋白，由 nifH 基因編碼）和鉬鐵蛋白（也稱為NifDK蛋白，由 nifD 和 nifK 基因編碼）。此外，固氮酶的合成還需要3種金屬簇：[Fe4S4] cluster、P-cluster及 FeMo-cofactor [Mo–7 Fe–9S–C–homocitrate]。FeMo-cofactor位于NifDK蛋白上，是N2絡合和還原的場所，其他兩種金屬簇的功能是傳遞電子。固氮酶的合成需要至少11種固氮基因[ nifH、nifD、nifK、nifB、nifE、nifN、nifV、nifX、nifQ （或 hesA ） 、nifU 及 nifS ]。在植物中異源表達固氮酶面臨許多挑戰：將多個固氮基因同時導入植物、多個固氮基因在植物中協調表達、以及固氮酶相關蛋白在植物中的穩定性等。
本研究首次將13個固氮酶合成相關基因：來自多粘類芽孢桿菌（ Paenibacillus polymyxa ）的11個基因（ nifH 、 nifD 、 nifK 、 nifX 、 nifE 、 nifB 、 nifN 、 nifV 、 hesA 、 groES 和 groEL ）和來自產酸克雷伯菌 ( Klebsiella oxytoca ) 的2個基因（ nif U 和 nif S） ，構建在3個植物表達載體，并通過農桿菌介導的單轉化和共轉化導入水稻中。對篩選獲得的T1代轉基因水稻進行雜交, 篩選獲得含有全部13個固氮基因的第一代（F1）代雜交水稻，再通過水稻連續自交獲得了第4代 (F4) 轉基因水稻植株。通過PCR和RT-PCR分析, 從256個F4代轉基因水稻株系中, 鑒定獲得了55個攜帶全部13個固氮酶合成相關基因的轉基因基因水稻株系（圖1）。
圖1.利用合成生物學方法將13個固氮基因導入水稻的試驗方案。陽性植株表示含固氮基因。
隨機選取3個F4 轉基因水稻株系（L8-17、L12-13及L7-15）進行深入研究。PCR分析表明，13個固氮基因在L8-17株系和L12-13株系中均能穩定遺傳，而13個固氮基因在L7-15株系中呈現3:1分離。水稻基因組重測序結果表明，在L8-17株系和L12-13株系中，13個固氮基因均插入到水稻1號染色體的2個位點（圖2）。而在L7-15株系中，13個固氮基因插入到水稻2個不同的染色體上。
圖2.F4 轉基因水稻株系L8-17中13個固氮基因（ nif ）在水稻1號染色體的2個插入位點及其排列。
(A) 9 個固氮基因 ( nifH nifD nifK nifX hesA nifB nifE nifN nifV ) 在水稻1號染色體上的插入位點及其排列。
(B) 4 個固氮基因 ( nifU nifS groES groEL ) 在水稻1號染色體上的插入位點及其排列。
qRT-PCR分析表明，13個固氮基因在3個F4 轉基因水稻株系（L8-17、L12-13及L7-15）中，以不同水平轉錄（圖3A）。Western blot分析表明，11 個Nif蛋白 (NifB、NifH、NifD、NifK、NifE、NifN、NifV、NifX、HesA、NifS 及 GroEL) 在在水稻株系L8-17的細胞質中穩定表達（圖3B）。而且，NifD和NifK在水稻細胞質中能形成穩定的NifDK四聚體（圖3C），該NifDK四聚體是形成有活性的固氮酶所必需的。同時，發現水稻細胞質中合成的NifH蛋白分子量比固氮細菌P. polymyxa NifH分子量小約1.8 kDa, 推測NifH被植物細胞質中的蛋白酶切割。
圖3.F4 轉基因水稻中固氮基因（nif ）轉錄和固氮酶蛋白（Nif）表達。
(A) qRT-PCR分析13個固氮基因(nifB nifH nifD nifK nifE nifN nifX hesA nifV nifS nifU groES groEL ) 在3個F4 轉基因水稻株系L8-17、L12-13及 L7-15中的轉錄水平。
(B) Western blot 分析F4 轉基因水稻株系L8-17中，11 個Nif 蛋白(NifB、NifH、NifD、NifK、NifE、NifN、NifV、HesA、NifX、 NifS及GroEL)的表達。
(C) Western blot（厭氧和非變性電泳）分析F4 轉基因水稻株系 L8-17中NifDK四聚體的合成。
本研究發現在水稻細胞質中表達的NifH 蛋白的分子量變小。為解決NifH在植物細胞質中不穩定性問題，對NifH蛋白氨基酸序列進行以系列缺失和氨基酸替代、以及利用煙草煙瞬時表達系統進行研究，結果表明NifH的切割發生在第17位蘇氨酸（T）和第18位絲氨基酸（S）之間。13個NifH氨基酸替代突變體（T17A、T17C、T17I、T17M、T17S、T17V、S18A、S18C、S18G、S18L、S18Q、S18T 及 Q19 A），能使 P. polymyxa Δ nifH 突變株恢復固氮酶活性，特別是3個NifH突變體 (T17C、T17V及S18A) 能使Δ nifH 突變株分別恢復到59.4~71.9%固氮酶活性；煙草瞬時表達也證明這13個NifH氨基酸替代突變體在煙草細胞質中不再被蛋白酶切割（圖4）。
本研究發現在水稻細胞質中表達的NifH 蛋白的分子量變小。為解決NifH在植物細胞質中不穩定性問題，對NifH蛋白氨基酸序列進行以系列缺失和氨基酸替代、以及利用煙草煙瞬時表達系統進行研究，結果表明NifH的切割發生在第17位蘇氨酸（T）和第18位絲氨基酸（S）之間。13個NifH氨基酸替代突變體（T17A、T17C、T17I、T17M、T17S、T17V、S18A、S18C、S18G、S18L、S18Q、S18T 及 Q19 A），能使 P. polymyxa Δ nifH 突變株恢復固氮酶活性，特別是3個NifH突變體 (T17C、T17V及S18A) 能使Δ nifH 突變株分別恢復到59.4~71.9%固氮酶活性；煙草瞬時表達也證明這13個NifH氨基酸替代突變體在煙草細胞質中不再被蛋白酶切割（圖4）。
本研究是國內外首次將13個基因組成的固氮酶合成途徑導入水稻中，為實現禾本科植物“自主固氮”提供了重要參考。同時，為預測和解決固氮酶組分及其他原核蛋白在植物細胞質中不穩定性提供有效途徑。
我校生物學院陳三鳳教授為論文通訊作者，在讀博士生尚益民和畢業博士生石皓文（現在工作單位是天津市農業科學院）為論文的共同第一作者。研究得到了“十四五”國家重點研發計劃《高效抗逆固氮體系的人工設計與應用示范》項目資助。