2023年12月5日，西湖大學黨波波團隊在Nature Communications雜志在線發表題為“Copper assisted sequence-specific chemical protein conjugation at a single backbone amide” 的研究論文。此研究開發了一種基于主鏈酰胺鍵單一位點選擇性的蛋白質化學偶聯方法，用于蛋白質特定位點標記，抗體偶聯藥物制備。

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https://doi.org/10.1038/s41467-023-43753-7

蛋白質由不同氨基酸通過主鏈酰胺鍵串聯形成。一個含有n個氨基酸的蛋白質有n-1個主鏈酰胺鍵。這些主鏈酰胺鍵極其相似，化學反應活性相比很多氨基酸側鏈也低很多。那是否有可能完全通過化學手段實現蛋白質主鏈酰胺鍵選擇性的化學修飾？在此之上，是否有可能通過化學手段在生物相容性的條件下實現復雜蛋白質上單一主鏈酰胺鍵的化學選擇性修飾？這顯然是一個非常大的挑戰。而這種全新的蛋白質單一位點選擇性化學修飾方法對于蛋白質性質、功能的基礎研究、蛋白質-小分子偶聯藥物的轉化研究都具有非常重要的意義。

目前，蛋白質單一位點選擇性的修飾大都依賴于基因密碼子拓展技術、或生物偶聯酶，然而由于技術路線相對復雜，這些方法應用范圍受到一定限制。

與此相比，蛋白質的直接化學偶聯方法操作簡便、成本低廉，在很多應用場景上更受青睞。然而，目前絕大多數化學偶聯方法僅具備化學選擇性，往往缺乏對單一位點的選擇性。

為了突破這一瓶頸，黨波波團隊提出了一種創新的策略：通過金屬離子特異性識別一段完全由天然氨基酸組成的多肽序列，來實現單一位點特異性的蛋白質化學偶聯（圖1）。基于此策略，黨波波團隊成功開發出一種單一主鏈酰胺鍵選擇性的CAST（多肽序列-FFKKDDHAA-的）蛋白質化學偶聯技術。反應動力學的研究顯示，CAST偶聯速率常數為8.1 M−1 s−1，t1/2不到2分鐘。

圖1. “金屬結合靶向”策略示意圖。M為過渡金屬離子，L為金屬配體，R-X為活性小分子

基于CAST技術，黨波波團隊成功地在多種蛋白質上均可實現高效、位點可控的蛋白質單一位點選擇性化學修飾。此定點化學修飾反應在完全生物相容條件下（水溶液，中性pH，低微摩爾蛋白濃度），在2小時內可以實現定量轉化（圖2）。

圖2. C端融合CAST的蛋白質與各類功能性硼酸小分子的反應

抗體偶聯藥物（ADC）是一類近年來非常受關注的靶向藥物，通過結合單抗的細胞選擇性和小分子毒素的細胞毒性，選擇性地殺傷惡性細胞。而制備ADC藥物的關鍵技術就是抗體藥物上的定點化學偶聯技術。黨波波團隊隨后將改進的、具有超高血漿穩定性的CASTi（-IAPDDHAA-）用于制備新的ADC藥物Tra-CASTi-MMAE，此藥物在產物均一性、穩定性方面都勝過目前臨床上、或臨床研究中所使用的大多數ADC藥物。基于CASTi制備的Tra-CASTi-MMAE在HER2陽性人卵巢癌SK-OV-3（HER2+++）和人乳腺導管腺癌JIMT-1（HER2++）異種移植小鼠模型中具有顯著的抗腫瘤功效（圖3）。

圖3. a. Tra-CASTi-MMAE結構；b-c. Tra-CASTi-MMAE的體內抗腫瘤效果

總的來說，在此工作中，黨波波團隊提出了一種全新的蛋白質單一位點選擇性化學修飾策略。基于此策略，黨波波團隊開發出了第一個單一主鏈酰胺鍵選擇性的蛋白質化學修飾方法CAST，并將CAST用于多種蛋白質單一位點選擇性標記，也用CAST制備了全新的均一、穩定、高體內活性的抗體偶聯藥物。因為CAST技術超高的效率以及選擇性，未來CAST技術在蛋白質藥物偶聯物開發中將很有可能代替目前常用的化學方法或生物酶法，有很大的應用前景。

西湖大學2019級博士研究生郭夢準、郭樑，2021級博士研究生趙愷，浙江大學第二附屬醫院周瑞為研究共同第一作者，西湖大學黨波波研究員、周挺研究員，雷英杰助理研究員為通訊作者。浙江大學楊兵教授，西湖大學黃晶研究員、章永登研究員提供了大力支持與幫助。本研究受到國家自然科學基金，西湖大學及西湖實驗室的資助和支持。

西湖大學黨波波團隊圍繞蛋白質工程，綜合運用蛋白質化學合成，蛋白質設計，高通量蛋白質篩選等方法一方面開發蛋白質研究的新型技術手段，另一方面針對靶點蛋白，開發多肽、蛋白類大分子藥物。

團隊目前正積極招聘細胞生物學、化學生物學、有機化學、分子生物學等方向的研究人員。