讓我們乘坐時光機，前往東晉的夏日夜晚。
有一位名為車胤的少年，由于家境貧寒，會在黑暗的夜晚出門捕捉螢火蟲。他把它們裝在白色絲袋中，照亮書本。聚集在袋子里的螢火蟲們不會知道，它們的光亮，點亮了車胤官至吏部尚書的平步青云之路，也促成了比喻學習勤奮的成語“囊螢夜讀”。
現在，我們返回1700年后的當下。
與車胤的故事相似，西湖大學生命科學學院PI宋春青、申恩志的團隊合作，在細胞微觀維度上聚攏了“螢火蟲”，研發出能夠更自如、更靈活地照亮DNA這本浩瀚之書的基因“探照燈”——CRISPR FISHer技術。
近日，他們的研究論文“CRISPR FISHer enables high-sensitivity imaging of nonrepetitive DNA in living cells through phase separation-mediated signal amplification”在Cell Research雜志在線發表、并被選為封面文章。
CRISPR FISHer，即實現了活細胞單拷貝基因成像的標記系統（或稱，基于相分離信號放大的高敏活細胞DNA元件示蹤方法），是基于CRISPR技術而來。它具有追蹤任何特定細胞固有或外源DNA序列的潛力，極大地拓寬了活細胞成像的應用范圍，為生物學過程研究和生物醫學診斷的進一步發展奠定了基礎。
PART 01 “基因剪刀”CRISPR：我可以照亮基因之書
我們都知道，你之所以是你，我之所以是我，是由于我們每個人擁有著獨一無二的基因組（指生物體所有遺傳物質的總和）。基因組就像是一本特別的書，以基因片段為“字詞”，記載著我們的個人信息，也將在我們的一生中發揮重要作用。
CRISPR技術，是基因編輯技術的一種，常被比擬為“基因剪刀”。它能夠針對性地對基因組之書的錯誤靶點進行剪切，在提供模板的情況下可以進行錯誤“糾正”——簡要理解，就是找到錯誤的地方，“剪”掉錯誤的內容，然后“替換”成正確的字詞。
這得益于它的核心組成部分，gRNA和Cas9蛋白。gRNA（也叫guide RNA，即向導RNA），是這把“剪刀”的導航，能夠在基因組的“字詞”海洋里找到出錯的地方、規劃抵達的路線；Cas9核酸內切酶，則是“剪刀”的刀鋒，能沿著路線抵達指定位置，并一刀切下去。
當然，以上是CRISPR技術最基礎的應用方式，隨著CRISPR基因編輯技術的發展，2013年，科學家們發現了CRISPR的另一種作用——“剪刀”喪失剪切功能（dCas9，即核酸酶失活形式的Cas9），但卻帶著“燈”（EGFP，增強綠色熒光蛋白）鎖定并照亮基因組的“段落”；自此，CRISPR成像技術在基因成像領域嶄露頭角。
這種帶“燈”的CRISPR有什么用？
比如，我們可以去觀察基因本身，去看一個染色體的狀態、記錄染色體的運動，也就是當下“流行”的4D染色體研究；又比如，我們可以觀察病毒DNA入侵細胞的過程；再比如，可以幫助我們研究癌癥的原理，研究諸如染色體易位這樣的異常染色體狀態與癌癥發生的關系；還有，我們可以觀察攜帶基因的載體是否將DNA帶到“目的地”，例如，實時動態追蹤用于治療遺傳性視網膜疾病和脊髓性肌萎縮癥的AAV載體是否承載了療效基因……
看到了這盞“燈”的強大作用后，很多科學家開始聚焦于基于CRISPR技術的活細胞成像研究。最初科學家通過增加向導RNA（即gRNA,“導航”）的量來招募更多的熒光蛋白（即“燈”）照亮局部位點，但是多個“導航”很難同時進入同一個細胞；與此同時，在細胞中游離的“燈”會產生很強的背景光亮，這就使得目標位點的光照分辨率變的很低。2016年，CRISPRainbow活細胞成像系統面世，它像一串彩虹色“霓虹燈”，能實現基因組不同位點的標記；2018年，又誕生了CRISPR-Sirius系統，一個“導航”能夠攜帶更多個數的“燈泡”，從而實現更高分辨率的成像……
PART 02 CRISPR FISHer:強大的“基因探照燈”，來了！
較之在基因成像領域更傳統、更廣泛應用的DNA原位雜交技術（需要將細胞固定，DNA變性后才能實現,不能實時記錄DNA的狀態），基于CRISPR技術的“燈”可以在細胞中的靶位點DNA非變性的情況下，實現DNA在活細胞內的動態成像。然而，這樣的“燈”目前能照亮、使我們能讀到的，僅限于基因組的“書”中那些在同一頁中重復出現的內容，也就是臨近位置重復出現多次的DNA序列（即成簇存在的多拷貝位點）。
而在我們人類的基因組的“書”中，大多數都是非重復的內容，即單拷貝基因。于是，超過65%的人類基因組序列利用現有的成像系統很難檢測得到。也就是說，現在給基因“書”用的“燈”，不管怎么打造，總是不夠“亮”，很難讓我們看清書中那些處于細微處且只出現一次的“字詞”。
是否可以做出一盞更厲害的基因燈？有了這個理想，西湖大學宋春青實驗室和申恩志實驗室合作，歷經近兩年，最終，CRISPR FISHer誕生了。
東晉少年車胤之所以聚攏螢火蟲，是因為單只螢火蟲的光很微弱，且它們分散在大自然中，無法照亮書頁；但在聚集后，微弱之光便變強了。同樣的，CRISPR FISHer系統，正是在先前版本的CRISPR成像系統上，聚攏了更多的“燈”，實現了在基因維度更強大的成像功能——因而，我們無懼所需照亮的基因“字詞”之細小，能夠閱讀DNA書本的更多細節內容了。
具體來說，該系統由dCas9蛋白，包含2個PP7配體的sgRNA(sgRNA-2×PP7)和foldon-GFP-PCP蛋白組成。在成像標記的過程中，dCas9（即“鈍刀”的刀鋒，上文所述的不會切割的Cas9蛋白）和sgRNA-2×PP7（可理解為導航兼連接支架）會首先在目標DNA序列位點穩定結合，并充當“種子”，使得foldon-GFP-PCP（即“燈”）和其余的sgRNA-2×PP7在目標DNA位點處快速聚集，從而通過相分離的方式最大化募集GFP熒光蛋白“燈”至標記位點（可以理解為形成更龐大的串聯的結構，“刀鋒-支架-燈”基礎上，可以繼續串聯更多的“支架-燈”結構，形成“刀鋒-支架-燈-支架-燈-支架-燈……”），同時大大降低細胞核背景中彌散的GFP信號（如圖一）。
圖一
隨后，為了驗證CRISPR FISHer系統的功能是否強大，研究團隊開展了一系列驗證實驗。
他們證實，CRISPR FISHer超越了已有“基因燈”的技術。在相同的拍攝條件下，CRISPR FISHer所標記的端粒熒光強度信噪比最高可以達到246，遠遠高于傳統的成像系統（信噪比在2左右）（圖二）。這說明，在照亮基因“書”的重復內容時，因為光更強，所以我們有機會看得更清楚了。
圖二
之后他們證實，那些在書中僅僅出現一次的內容，也就是之前人類沒法“看到”的那些單拷貝基因，現在也能看清了。團隊發現，相對于對照組細胞呈現出的彌散綠色熒光信號，在CRISPR FISHer所標記的PPP1R2基因的細胞中可以明顯的觀察到2-4個熒光信號點（如圖三a和圖三b），這說明CRISPR FISHer系統是具備單拷貝基因成像標記能力的，并且在單拷貝基因的成像標記過程中表現出很好的特異性，能夠“看到”基因“書”中的特定的、只出現一次的“字詞”內容。
最讓研究團隊興奮的是，他們發現——當基因“書”被某些因素影響發生改變，成了不常規的“書”，比如，基因組不穩定性或染色體結構變異可誘導DNA損傷和修復，有時會產生染色體外的DNA；或者，一些外源入侵者，例如病毒，可以感染細胞并將其基因組傳遞到細胞核中，導致細胞功能障礙和疾病的發生發展——這些時候，這盞“燈”依然能帶著我們看清楚最新情況。
圖三
PART 03 從利刃到鈍刀，他們致力于“透視”基因層面的人類病痛
不知道千百年前，終于以螢蟲之光照亮夜間學海之路的車胤，是否為此激動不已。總之對于創新了CRISPR FISHer活細胞單拷貝基因成像標記系統的宋春青團隊和申恩志團隊來說，他們對于打造一盞世界上前所未有的“燈”，去照亮、去看見那些在“黑暗”中的基因，等待已久。
研究團隊
從有想法到最終實現，他們整整走了近兩年。事實上，兩年是往短了說的。這次之所以能夠實現原創的突破性的基因成像技術，與研究者們關于CRISPR更早期、更長年累月的研究密不可分。
早在2015年至2019年在麻省大學醫學院RNA治療研究所進行博士后研究時，宋春青接觸了CRISPR技術，并且練就了如何在“利刃”CRISPR上玩出花的本領——也就是常規意義上的“基因剪刀”的基因編輯功用。正是基于“利刃”的研究經驗，熟悉了CRISPR的基本原理，做“鈍刀”燈，才會勢如破竹。
宋春青
展望未來，CRISPR FISHer由于擁有能夠追蹤任何特定內源或外源DNA序列的潛力，將極大地拓寬了活細胞成像技術的應用范圍，為生物學過程研究和生物醫學診斷的發展奠定基礎。換句話說，擁有了這盞超強基因“探照燈”，我們能夠看到基因的更多動態，挖掘更多關于人類身體機理和疾病的“秘密”。
西湖大學生命科學學院宋春青課題組2020級博士生呂欣原，博士后鄧遠，2020級博士生黃曉燕，和申恩志課題組2020級博士生李珍珍為該論文的共同第一作者。西湖大學生命科學學院宋春青研究員和申恩志研究員為該論文的共同通訊作者。